【摘要】：馬立克氏病(MD)是由馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種高度傳染的病毒性腫瘤疾病,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。不同品種(系)雞對(duì)馬立克氏病(MD)具有不同的遺傳抗性,遺傳抗性較強(qiáng)的雞可能會(huì)長期停留在潛伏感染階段,在經(jīng)歷一個(gè)短暫的晚期溶細(xì)胞感染后形成腫瘤,而易感雞體內(nèi)病毒不斷增殖,未出現(xiàn)腫瘤即早期死亡,造成抗性雞與易感雞腫瘤形成差異的分子調(diào)控機(jī)制至今并未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)宿主miRNA具有抗病毒免疫應(yīng)答功能很可能在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。我們前期以自主培育的B21(抗性)和B19(易感)單倍型雞為模型,利用高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了B21和B19雞在MDV病毒感染三個(gè)關(guān)鍵階段(5、10和21dpi)法氏囊組織miRNA的差異表達(dá)譜,篩選出一些可能與MHC-B單倍型雞MD抗性相關(guān)的miRNA。為從宿主miRNA調(diào)控角度進(jìn)一步探索抗性雞與易感雞腫瘤形成差異的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)在前期差異表達(dá)譜的基礎(chǔ)上選擇gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p為對(duì)象進(jìn)行深入研究。我們首先利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果,并進(jìn)一步分析gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p在其它免疫器官的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p在抗性雞和易感雞感染后的法氏囊和脾臟組織中表達(dá)量明顯高于非感染組。進(jìn)一步利用TargetScan和miRDB兩個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p的靶基因,取兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)交集并結(jié)合免疫相關(guān)通路分析進(jìn)行篩選。gga-miR-21-5p選取SATB1、TIAM1和PITX2,gga-mi R-146b-5p選取NOVA1、DOT1L和NFATC2作為候選基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過雙熒光酶素報(bào)告分析,我們發(fā)現(xiàn)gga-miR-21-5p可顯著抑制SATB1 3’-UTR區(qū)的報(bào)告基因活性,使其下調(diào)33%,表明gga-miR-21-5p與預(yù)測(cè)靶基因SATB1之間存在相互作用。同時(shí),Western blot分析發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染MSB-1細(xì)胞72小時(shí)后,gga-mi R-21-5p過表達(dá)顯著抑制SATB1蛋白表達(dá),相反抑制gga-miR-21-5p表達(dá)會(huì)促進(jìn)SATB1蛋白表達(dá)。為了進(jìn)一步檢測(cè)gga-miR-21-5p對(duì)MSB-1細(xì)胞增殖和遷移的影響,我們利用CCK-8和trans-well的方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染外源gga-miR-21模擬物和抑制劑24-72小時(shí)后MSB-1細(xì)胞過表達(dá)細(xì)胞增殖速度呈顯著下降趨勢(shì)。同時(shí),過表達(dá)gga-miR-21后,MSB-1細(xì)胞遷移能力也顯著下降。本研究表明gga-mi R-21-5p可以靶向調(diào)控SATB1基因表達(dá),并且對(duì)馬立克氏病腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移具有一定的抑制作用。
【圖文】：

圖 3-1 pmirGLO 雙熒光素酶表達(dá)載體Figure 3-1 Information of pmirGLO Vector3.2.4.2 重組載體的轉(zhuǎn)化

M NOVA1 DOT1L DOT1L NFATC2 NFATC2圖 3-2 gga-miR-21-5p 靶基因擴(kuò)增Figure 3-2 The target gene amplification of gga-miR-21-5p
【學(xué)位授予單位】：牡丹江師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 常爽;非主要組織相容性復(fù)合體宿主遺傳變異對(duì)馬立克氏病疫苗效力的影響[D];吉林大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：2561527