【摘要】：雞球蟲病在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的健康發(fā)展,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,該病主要是由艾美耳屬球蟲寄生于雞腸道引起。在7種艾美耳球蟲中,柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是分布最廣、致病力最強(qiáng)的球蟲之一,它寄生在盲腸的黏膜下,引起出血性腸炎,可導(dǎo)致雞死亡。雞球蟲屬于頂復(fù)器門原蟲,頂復(fù)器門原蟲是一類專一性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲,這類寄生蟲盡管入侵的宿主細(xì)胞各不相同,但它們都有一個共同保守的入侵機(jī)制,當(dāng)蟲體黏附宿主細(xì)胞后,在蟲體頂端與宿主細(xì)胞膜表面形成一個緊密的運(yùn)動接觸環(huán)(Moving Junction,MJ),這一特殊結(jié)構(gòu)在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)由微線體分泌的頂體膜抗原1(Apical membrance protein-1,AMA1)是組成MJ的關(guān)鍵分子,因此,與AMA1相互作用的分子可能參與形成MJ,并在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中必不可少。為了弄清楚柔嫩艾美耳球蟲AMA1的相互作用分子以及在蟲體入侵過程中發(fā)揮的作用,本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù),以柔嫩艾美耳球蟲頂體膜抗原1(Et AMA1)為誘餌,篩選了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交c DNA文庫,獲得一些可能與Et AMA1相互作用蛋白的ESTs序列。本研究選取其中編號為559和39的兩個EST序列,對其進(jìn)行克隆、表達(dá)和功能初步分析,并對其與Et AMA1的相互作用關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。1.柔嫩艾美耳球蟲CHP559和CHP39基因的克隆及生物信息學(xué)分析選取的兩個EST序列均含有3’末端的Ploy(A)尾,利用5’RACE技術(shù)獲得了這兩個基因含完整開放閱讀框的全長c DNA序列,編號559與39基因的ORF分別與柔嫩艾美耳球蟲保守的假想蛋白(hypothetical protein,conserved)ETH_00024035與ETH_00029745有100%同源,因此,分別將2個基因命名為Et CHP559和Et CHP39。Et CHP559基因全長1 746 bp,ORF長1 224 bp,編碼407個氨基酸,編碼蛋白的分子量為46.04 k Da,有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,沒有保守結(jié)構(gòu)域,有15個抗原位點(diǎn)。Et CHP39基因全長1 344 bp,ORF長873 bp,編碼290個氨基酸,預(yù)測分子量為32.6 k Da,無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,沒有保守結(jié)構(gòu)域,有9個抗原位點(diǎn)。經(jīng)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),Et CHP559基因在孢子化卵囊和子孢子發(fā)育階段有轉(zhuǎn)錄,子孢子階段的轉(zhuǎn)錄水平最高,表明Et CHP559是在子孢子階段高效表達(dá)的基因。Et CHP39基因在4個發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄水平不同,其中在孢子化卵囊階段轉(zhuǎn)錄水平最高,其次在未孢子化卵囊的轉(zhuǎn)錄水平高于子孢子和裂殖子,表明Et CHP39基因的轉(zhuǎn)錄水平受到蟲體階段性的調(diào)控。2.柔嫩艾美耳球蟲兩個保守蛋白Et CHP559和Et CHP39的原核表達(dá)及功能初步研究將Et CHP559基因克隆到原核表達(dá)載體p GEX-4T-2和p Cold-TF中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了重組蛋白GST-Et CHP559和His-Et CHP559,其中重組蛋白GST-Et CHP559為包涵體表達(dá),重組蛋白His-Et CHP559有可溶性表達(dá)。將Et CHP39基因克隆到原核表達(dá)載體p ET28a中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了重組蛋白His-Et CHP39,且以包涵體形式表達(dá)。分別利用Ni柱親和層析和切膠純化的方式獲得了重組蛋白His-Et CHP559和His-Et CHP39,用純化的蛋白免疫家兔獲得多抗血清,經(jīng)Western-blot分析表明重組蛋白Et CHP559和Et CHP39都具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。采用間接免疫熒光定位技術(shù)對Et CHP559和Et CHP39蛋白在球蟲不同發(fā)育階段的分布和定位進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,Et CHP559蛋白在未入侵前主要位于子孢子的表面,當(dāng)準(zhǔn)備入侵時該蛋白的表達(dá)量上升并趨向于頂端,在子孢子接入DF-1細(xì)胞2 h后,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要位于蟲體的頂端,子孢子入侵DF-1細(xì)胞24 h后,蛋白的表達(dá)增加,且逐漸往蟲體的后端分泌;Et CHP39在未入侵前主要位于子孢子的頂端,當(dāng)準(zhǔn)備入侵時該蛋白分泌到子孢子的表面以及頂端,子孢子加入DF-1細(xì)胞2 h后,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要位于蟲體的頂端,入侵DF-1細(xì)胞24 h后,蛋白的表達(dá)增加,且逐漸往蟲體的后端分泌,當(dāng)蟲體發(fā)育為裂殖子時,該蛋白也主要位于裂殖子的頂端。通過體外抑制實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的多抗對子孢子入侵DF-1細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,anti-r Et CHP559抗體作用子孢子后,與正常兔血清Ig G組相比子孢子入侵DF-1細(xì)胞的能力明顯下降,且隨著抗體濃度的不斷增大,作用后子孢子入侵力逐漸降低,抗體抑制率逐漸升高,當(dāng)抗體濃度為300μg/m L,抑制率高達(dá)70%;anti-r Et CHP39抗體作用子孢子后,與對照組相比子孢子入侵DF-1細(xì)胞的能力下降,且隨著抗體濃度的不斷增大,作用后子孢子入侵力逐漸降低,抗體抑制率逐漸升高,當(dāng)抗體濃度為400μg/m L,抑制率為30%左右。3.柔嫩艾美耳球蟲CHP559和CHP39蛋白與AMA1蛋白互作關(guān)系的驗(yàn)證利用真核表達(dá)的蛋白對Et CHP559和Et CHP39蛋白與Et AMA1蛋白的相互作用關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。將Et CHP559和Et CHP39基因分別克隆至真核表達(dá)載體pc DNA3.1-flag和p Bi FC-VC155,同時將Et AMA1基因分別克隆至真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)和p Bi FC-VN155,所構(gòu)建的真核重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),經(jīng)Western-blot和間接免疫熒光鑒定所構(gòu)建的真核重組表達(dá)質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。利用構(gòu)建的pc DNA3.1-flag-Et CHP559、pc DNA3.1-flag-Et CHP39和pc DNA3.1-Et AMA1質(zhì)粒進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示Flag單抗可以沉淀DF-1細(xì)胞中表達(dá)的Et CHP559和Et CHP39蛋白,卻不能同時沉淀DF-1細(xì)胞中表達(dá)的Et AMA1蛋白;利用構(gòu)建的p Bi FC-VC155-Et CHP559、p Bi FC-VC155-Et CHP39和p Bi FC-VN155-Et AMA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后進(jìn)行雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組細(xì)胞均不能檢測到明顯熒光,陽性對照組細(xì)胞有明顯綠色熒光。結(jié)果說明通過上述方法未能檢測出Et CHP559和Et CHP39與Et AMA1存在相互作用。
【圖文】：

圖 4.10 BiFC 分析蛋白之間的相互作用lecular Fluorescence Complementation assay to analyze the prnVN173 和 pBiFC-bFosVC155 的 DF-1 細(xì)胞；B：共轉(zhuǎn)染 pBiF DF-1 細(xì)胞；C：共轉(zhuǎn)染 pBiFC-VC155-EtCHP39 和 pBiFC-VN1轉(zhuǎn)染 pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155 的 DFsfected with pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFosVC155; B: DF-1 ce 和 pBiFC-VN155-EtAMA1 ; C: DF-1 cells were co-transfected wi1; D: DF-1 cells were co-transfected with pBiFC-bJunVN173和pB用抗 rEtCHP559 和 rEtCHP39 的兔源多抗與抗 rEtA1 與 EtCHP39 和 EtAMA1 做了天然蛋白的免疫熒光共h 后，EtCHP559 蛋白和 EtAMA1 蛋白都同時定位在蟲是同時定位在蟲體頂端，這說明在子孢子入侵細(xì)胞過程雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，，推測 EtCHP559 和 EtCHP39 蛋白系。

圖 4.10 BiFC 分析蛋白之間的相互作用lecular Fluorescence Complementation assay to analyze the prnVN173 和 pBiFC-bFosVC155 的 DF-1 細(xì)胞；B：共轉(zhuǎn)染 pBiF DF-1 細(xì)胞；C：共轉(zhuǎn)染 pBiFC-VC155-EtCHP39 和 pBiFC-VN1轉(zhuǎn)染 pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155 的 DFsfected with pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFosVC155; B: DF-1 ce 和 pBiFC-VN155-EtAMA1 ; C: DF-1 cells were co-transfected wi1; D: DF-1 cells were co-transfected with pBiFC-bJunVN173和pB用抗 rEtCHP559 和 rEtCHP39 的兔源多抗與抗 rEtA1 與 EtCHP39 和 EtAMA1 做了天然蛋白的免疫熒光共h 后，EtCHP559 蛋白和 EtAMA1 蛋白都同時定位在蟲是同時定位在蟲體頂端，這說明在子孢子入侵細(xì)胞過程雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推測 EtCHP559 和 EtCHP39 蛋白系。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 沈瑤瑤;嚴(yán)慶豐;;蛋白質(zhì)相互作用研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2013年03期

本文編號：2560005