【摘要】：為研究豬Viperin蛋白對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)復(fù)制的抑制作用,通過RTPCR方法擴增豬Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭載體p Ad Track-CMV,經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定后進行測序。將PmeⅠ內(nèi)切酶線性化的重組穿梭載體質(zhì)粒(p Ad Track-s VIP)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,與腺病毒骨架載體p Ad Easy-1進行同源重組,提取重組后的腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)內(nèi)切酶PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞,裝配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重組腺病毒r Ad-s VIP感染細胞后,可見綠色熒光蛋白的表達。RT-PCR、Western blot檢測結(jié)果表明,重組腺病毒r Ad-s VIP可正確表達豬Viperin蛋白,且表達的豬Viperin蛋白具有良好的反應(yīng)原性,對PRRSV的復(fù)制具有明顯的抑制作用。
【圖文】：

CO2條件下培養(yǎng)24h，接種PＲＲSV(BB0907)病毒液(MOI=0．01)，37℃培養(yǎng)48h。分別收集細胞，用細胞裂解液充分裂解細胞，然后用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，Westernblot檢測PAM細胞內(nèi)豬Viperin蛋白的表達和PＲＲSV在細胞內(nèi)復(fù)制情況，以β－actin為內(nèi)參。其中，一抗分別為鼠抗豬Viperin多克隆抗體、PＲＲSVN蛋白單克隆抗體、β－actin單克隆抗體，二抗為羊抗鼠HＲP－IgG。2結(jié)果與分析2．1豬Viperin基因PCＲ擴增結(jié)果以pEASY－sVIP為模板，應(yīng)用引物rAd－F、rAd－Ｒ進行PCＲ擴增，可見與預(yù)期大小一致的條帶(圖1)。M．DNAMarker5000;1．PCＲ擴增產(chǎn)物圖1豬Viperin基因的擴增結(jié)果2．2腺病毒穿梭載體pAdTrack－sVIP的構(gòu)建與鑒定結(jié)果構(gòu)建的重組穿梭載體pAdTrack－sVIP經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約1089bp的目的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖2)。將酶切鑒定正確的重組穿梭載體pAdTrack－sVIP進行測序，測序結(jié)果采用DANStar128

第9期方劍玉等:表達豬Viperin蛋白重組腺病毒的構(gòu)建及其對PＲＲSV復(fù)制的抑制作用軟件與已知豬Viperin序列進行比較發(fā)現(xiàn)，成功構(gòu)建了重組穿梭載體。M．DNAMarker5000;1．pAdTrack－sVIP質(zhì)粒圖2重組穿梭載體pAdTrack－sVIP的酶切鑒定結(jié)果2．3重組腺病毒質(zhì)粒pAd－sVIP的鑒定結(jié)果將重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack－sVIP線性化后，電轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pADEasy－1的大腸桿菌感受態(tài)細胞BJ5183，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見2個條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明已成功將Viperin基因克隆入腺病毒基因組(圖3)。M．DNAMarker15000;1．pAd－sVIP質(zhì)粒圖3重組腺病毒質(zhì)粒pAd－sVIP酶切鑒定結(jié)果2．4重組腺病毒的轉(zhuǎn)染與病毒收獲將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd－sVIP轉(zhuǎn)染HEK－293A細胞后，熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光蛋白表達(圖4)，同時，顯微鏡下可見特異性細胞病變。A．轉(zhuǎn)染pAd－sVIP質(zhì)粒的HEK－293A細胞;B．空白HEK－293A細胞圖4重組腺病毒質(zhì)粒pAd－sVIP轉(zhuǎn)染HEK－293A細胞后的綠色熒光蛋白表達情況2．5重組腺病毒rAd－sVIP外源基因的表達與鑒定2．5．1ＲT－PCＲ檢測豬Viperin基因的表達收集重組腺病毒和野生型腺病毒的病毒液，用ＲNA提取試劑盒提取總ＲNA，，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCＲ擴增，擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到約1089bp大小的目的條帶，而野生型腺病毒無條帶(圖5)。表明重組腺病毒可正確表達豬Viperin基因。M．DNAMarker5000;1．野生型腺病毒rAd－wt對照;2．重組腺病毒rAd－sVIP圖5PCＲ檢測重組腺病毒rAd－sVIP豬Viperin基因表達情況2．5．2Westernblot鑒定豬Viperin的表達Wes-ternblot結(jié)果顯示，重組腺病毒組出現(xiàn)特異性條帶，而野生型腺病毒組無條帶，表明重組腺病毒可正確表達豬Viperin蛋白(圖6)。圖6W

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本文編號：2557387