【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通常情況下通過靶向mRNA的3′UTR序列,從而影響mRNA穩(wěn)定性或抑制蛋白翻譯。在成肌細(xì)胞的增殖與分化過程中,miRNAs發(fā)揮著重要調(diào)控作用。目前已知miR-133和mi R-27a能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖,miR-1和miR-206能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化,但仍有許多mi RNAs在成肌中的作用機(jī)制尚不清楚,需要作進(jìn)一步研究。本研究利用熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫熒光等技術(shù),旨在研究miR-125a-5p在成肌細(xì)胞增殖與分化過程中的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠C2C12細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料,利用miRNAs的模擬物(mimic)提高mi R-125a-5p的表達(dá)量或miRNAs的干擾劑(inhibitor)降低miR-125a-5p的表達(dá)量,從而研究miR-125a-5p在成肌細(xì)胞增殖與分化中的作用。依據(jù)miRNAs的作用機(jī)制,結(jié)合Targetscan生物信息學(xué)軟件,預(yù)測miR-125a-5p的靶基因,從中篩選出與成肌細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因。構(gòu)建包含mRNAs 3′UTR的psiCheck-2雙熒光素酶基因報(bào)告載體,與mimic共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞檢測熒光強(qiáng)度。獲得如下主要結(jié)果:1.MiR-125a-5p抑制C2C12細(xì)胞的增殖在C2C12細(xì)胞增殖階段,miR-125a-5p和E2F3的表達(dá)呈相反趨勢;過表達(dá)mi R-125a-5p抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)水平(P0.05),DNA復(fù)制(P0.05),并導(dǎo)致細(xì)胞G1期停滯(P0.05);干擾miR-125a-5p之后,細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)水平,DNA復(fù)制及細(xì)胞周期均不受影響。2.MiR-125a-5p對C2C12細(xì)胞分化無顯著影響過表達(dá)或干擾miR-125a-5p,均不影響成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoD與MyHC表達(dá)水平及成肌細(xì)胞分化指數(shù)。3.E2F3是mi R-125a-5p的靶基因干擾E2F3能夠抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)(P0.05);通過雙熒光素酶基因報(bào)告載體系統(tǒng)確定E2F3為miR-125a-5p的靶基因。綜上所述,過表達(dá)miR-125a-5p通過靶向作用于E2F3抑制C2C12細(xì)胞增殖,但對其分化不產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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本文編號：2553434