【摘要】：A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)可感染哺乳動物在內(nèi)的多種宿主,對公共衛(wèi)生安全造成了巨大的威脅。由于其基因組的多變性,IAV的致病性也因其基因亞型的多樣性表現(xiàn)出很大的差異。除此之外,IAV基因組的單個基因片段能表達多個病毒蛋白,而這使得IAV的致病機理變得更加復雜。20世紀70年代,科學家們首次描繪了IAV的基因組,發(fā)現(xiàn)其基因組能表達10種病毒蛋白,并將它們分別命名為PB2、PB1、PA、HA、NP、 NA、M1、M2、NS1和NS2。2001年,科學家又發(fā)現(xiàn)了一個由PB1的替代開放閱讀框所編碼的輔助蛋白,并將其命名為PB1-F2。此后,另外6個病毒輔助蛋白PB1-N40、PA-X、 M42、NS3、PA-N155和PA-N182也相繼被發(fā)現(xiàn)。PA-X是一個約29 kD的小蛋白,是IAV基因組片段3編碼的。Jagger等人已經(jīng)證實PA-X蛋白可以減弱1918 H1N1大流行流感病毒對小鼠的致病性,并能抑制宿主的先天性免疫應答,尤其是能夠顯著調(diào)節(jié)與炎癥及凋亡相關(guān)的免疫應答。Desmet等人發(fā)現(xiàn)該蛋白與宿主細胞關(guān)閉和抑制宿主的抗病毒應答相關(guān)。Khaperskyy等人則從應激顆粒(stress granule, SG)的角度闡釋了PA-X蛋白的作用,他們發(fā)現(xiàn)PA-X能抑制SG的形成。而最近高慧杰等人發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白可以抑制2009 H1N1大流感病毒和H5N1禽流感病毒對小鼠的毒力。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)PA-X削弱了高致病性H5N1禽流感病毒對小鼠、麻鴨和SPF雞的毒力,并且闡明了PA-X可能是通過抑制病毒的復制和宿主的免疫應答來減弱病毒對禽類的毒力。一、PA-X蛋白在H5N1高致病性禽流感病毒小鼠致病性中作用為了探索PA-X蛋白在H5N1禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)對哺乳動物致病性中的作用,我們以一株H5N1高致病性禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/k0402/2010(CK10)作為母本病毒,通過反向遺傳技術(shù)拯救了兩株P(guān)A-X蛋白表達量不同程度降低的突變株CK-PAX3和CK-PAX5。我們首先利用Western Blotting證實了兩株突變病毒CK-PAX3和CK-PAX5的PA-X蛋白表達量相對于母本病毒分別降低了53%和15%。之后在小鼠的致病性實驗中,我們發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白表達量降低之后,H5N1 AIV對BABL/c小鼠的致病性增強了,體現(xiàn)在突變株感染組的小鼠體重下降更快、程度更大,出現(xiàn)死亡的時間更早,而CK-PAX3和CK-PAX5感染組的半數(shù)致死劑量較母本病毒分別降低了7.5倍和3.5倍。該結(jié)果進一步驗證了Jagger等的結(jié)論,說明PA-X可能在不同亞型的禽流感病毒都起著類似的作用。另外,為了探索PA-X蛋白潛在的作用機制,我們進一步比較了重組病毒感染的小鼠肺臟的病理組織學變化。結(jié)果顯示,在感染后第1天,CK-PAX3組和CK-PAX5組的小鼠肺臟的病變嚴重程度都要高于r-CK10組。感染后第1天CK-PAX3感染組表現(xiàn)為嚴重的間質(zhì)性肺炎和支氣管肺炎,其病變嚴重程度打分為1.71土0.49,而r-CK10組僅表現(xiàn)為輕微的支氣管肺炎,病變嚴重程度打分僅為1±0。二、PA-X減弱H5N1病毒小鼠致病力的機理探索我們進一步探索了PA-X減弱H5N1病毒對小鼠毒力的可能機制。由于之前的研究顯示PA-X缺失株能引起更加嚴重的肺臟損傷,所以我們通過測定體外細胞的凋亡和壞死情況進一步驗證了重組病毒在誘導體外細胞的損傷中是否存在差異。利用annexin V和PI對MDCK和A549細胞進行雙染,我們發(fā)現(xiàn)降低PA-X的表達量能夠顯著提高細胞死亡的比例。為了進一步探索重組病毒引起肺臟不同程度病理學變化的可能原因,我們又比較了重組病毒在體內(nèi)、體外的復制能力。結(jié)果顯示,在哺乳動物細胞(包括A549, RAW和Vero)內(nèi),CK-PAX3的復制能力要顯著強于r-CK10。而小鼠臟器病毒滴度結(jié)果顯示PA-X蛋白表達量降低使突變株在小鼠體內(nèi)都具有相當?shù)膹椭苾?yōu)勢,表現(xiàn)在感染后第1天CK-PAX3和CK-PAX5感染組小鼠肺臟內(nèi)病毒滴度顯著高于r-CK10組、感染第3天CK-PAX3感染組小鼠脾臟內(nèi)病毒滴度顯著高于r-CK10組,而且突變株感染的小鼠臟器內(nèi)能檢測到病毒的小鼠數(shù)量多于母本病毒感染小鼠。然后,我們通過比較PA-X能否影響PA蛋白的核聚集能力來探索PA-X抑制病毒復制的可能原因。結(jié)果顯示,降低PA-X的表達量能夠顯著增強PA的核聚集。另外,通過體外重構(gòu)RNP實驗,我們發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白表達量降低之后,突變株的聚合酶活性要極顯著高于母本病毒。我們推測這可能是突變株復制能力增強的主要原因。為了進一步探索重組病毒引起肺臟損傷差異的機制,我們通過測定小鼠肺臟中細胞因子的表達水平評價了PA-X在誘導宿主炎癥反應中的作用�？傮w來說,與r-CK10相比,CK-PAX3誘導了更為強烈的細胞因子應答。在感染第1天, CK-PAX3誘導的CCL-3、CCL-4、CCL-5、CXCL-9、 CXCL-10、IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α等細胞因子的表達顯著高于r-CK10；而CK-PAX5也誘導了更為強烈的CCL-4、CCL-5、CXCL-9、IFN-β和IL-6等細胞因子的表達。這些結(jié)果顯示重組病毒的致病性差異以及不同程度的肺臟損傷很可能與宿主感染早期細胞因子的表達水平相關(guān)。本研究證實了PA-X蛋白能夠減弱H5N1高致病性禽流感病毒對小鼠的毒力。而降低PA-X的表達能加快PA蛋白向核內(nèi)聚集、增強病毒的體內(nèi)外復制能力、加速細胞死亡、誘導宿主更為強烈的炎癥應答。而這些可能都是突變株對小鼠致病性增強的原因�？傊�,本研究證明了PA-X是一種重要的毒力相關(guān)因子,為禽流感病毒的致病機制的研究提供了新的思路。
【圖文】：

圖３－１重組病毒在小鼠體內(nèi)的復制能力逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ｖｉｒａｌ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｉｎｆｅｃ化ｄ－ｍｉｃｅ．邋Ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｎｉｎｅ邋６－ｗｅｅｋ＿－ｏｌｄ邋ｆｅｍａｌｅ邋ＢＡＢＬ／ｃ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｔｉ＊ａｎａｓａｌｌｙ逡逑ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋１０５邋０ｅＩＤ５０邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓｅｓ．邋Ｏｎ邋ｄａｙ邋１，邋２邋ａｎｄ邋３邋ｐ．ｉ．，，邋ｔｈｒｅｅ邋ｍｉｃｅ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｗｅｒｅ逡逑ｅｕｔｈａｎｉｚｅｄ邋ｔｏ邋ｃｏｌｌｅｃｔ邋ｏｒｇａｎｓ邋ｆｏｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｔｉｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｅｇｇｓ．邋Ｖｉｒａｌ邋ｌｏａｄｓ邋ａｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ．邋Ｓｉｇｎｉｆｃａｎｔ逡逑－－

圖３－１重組病毒在小鼠體內(nèi)的復制能力逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ｖｉｒａｌ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｉｎｆｅｃ化ｄ－ｍｉｃｅ．邋Ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｎｉｎｅ邋６－ｗｅｅｋ＿－ｏｌｄ邋ｆｅｍａｌｅ邋ＢＡＢＬ／ｃ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｔｉ＊ａｎａｓａｌｌｙ逡逑ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋１０５邋０ｅＩＤ５０邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓｅｓ．邋Ｏｎ邋ｄａｙ邋１，邋２邋ａｎｄ邋３邋ｐ．ｉ．，邋ｔｈｒｅｅ邋ｍｉｃｅ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｗｅｒｅ逡逑ｅｕｔｈａｎｉｚｅｄ邋ｔｏ邋ｃｏｌｌｅｃｔ邋ｏｒｇａｎｓ邋ｆｏｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｔｉｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｅｇｇｓ．邋Ｖｉｒａｌ邋ｌｏａｄｓ邋ａｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ．邋Ｓｉｇｎｉｆｃａｎｔ逡逑－－
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 莫一群;PA-X蛋白在H5N1高致病性禽流感病毒小鼠致病性中的作用[D];揚州大學;2015年

本文編號：2552765