【摘要】：新城疫和禽流感是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的兩大動(dòng)物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是當(dāng)前的主要優(yōu)勢(shì)流行株。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白裝配而成的空心顆粒,不攜帶核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本試驗(yàn)將AIV HA胞外域與NDV F基因胞內(nèi)、跨膜域融合構(gòu)建FcH9融合序列;進(jìn)一步通過利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有FcH9序列的重組桿狀病毒rBV-FcH9,與實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9細(xì)胞,收集感染細(xì)胞上清,經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化嵌合VLPs。血凝血抑試驗(yàn)結(jié)果顯示嵌合VLPs中HN和HA效價(jià)均為28;Western blot分析表明該VLPs可以與特異性陽性血清發(fā)生反應(yīng);透射電鏡觀察該VLPs具有典型的病毒粒子結(jié)構(gòu)正,形態(tài)大小與野生型NDV相似。結(jié)果表明:本試驗(yàn)成功制備了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,為研制新型NDV-AIV二聯(lián)疫苗候選株奠定基礎(chǔ),并為當(dāng)前新城疫與H9N2亞型禽流感的防控提供策略。
【圖文】：

Ｈ９陽性血清各２５μＬ連續(xù)倍比稀釋（對(duì)照組不加血清），之后每孔滴加２５μＬＶＬＰｓ在３７℃孵育４５ｍｉｎ。最后每孔滴加２５μＬ１％雞紅細(xì)胞，冰上孵育３０ｍｉｎ后判定血凝效價(jià)。２結(jié)果２．１目的基因的擴(kuò)增與連接利用特異性引物，以ＦｃＤＮＡ和ＨＡｃＤＮＡ為模板，成功擴(kuò)增出Ｆ基因的胞內(nèi)域和跨膜域及ＨＡ的胞外域。擴(kuò)增產(chǎn)物利用特異性引物經(jīng)重疊延伸ＰＣＲ連接獲得ＦｃＨ９片段（１７５５ｂｐ），片段大小與預(yù)期相符（圖１）。圖１ＦｃＨ９嵌合基因重疊延伸ＰＣＲ擴(kuò)增Ｍ．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～５．ＦｃＨ９片段２．２重組桿狀病毒基因組的鑒定以Ｐ３代ｒＢＶ－ＦｃＨ９基因組為模板，分別用Ｍ１３引物和特異性引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，，可見４０５０ｂｐ左右的條帶和１２３９中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７

１７５０ｂｐ左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖２Ａ，Ｂ）。圖２重組桿狀病毒ＰＣＲ鑒定Ｍ１．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ａ１～Ａ４．重組桿狀病毒基因組Ｍ１３引物的ＰＣＲ產(chǎn)物；Ｍ２．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｂ１、Ｂ２．特異性引物ＰＣＲ產(chǎn)物２．３Ｓｆ９細(xì)胞病變觀察重組桿狀病毒共感染后可見Ｓｆ９細(xì)胞變大，內(nèi)部顆�；兴槠纬�，并逐漸脫落（圖３Ａ），圖３Ｂ為未接毒Ｓｆ９細(xì)胞。圖３Ｓｆ９細(xì)胞電鏡觀察Ａ．正常Ｓｆ９；Ｂ．病變Ｓｆ９２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測與鑒定將純化的ｃＶＬＰｓ進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測，使用Ｈ９陽性血清為一抗，結(jié)果可見在７５０００處出現(xiàn)目的條帶（圖４Ａ）；以ＮＤ陽性血清為一抗，結(jié)果可見與預(yù)期相符的條帶，ＨＮ蛋白大小約為７００００，Ｍ蛋白約４００００（圖４Ｂ）。圖４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定圖Ｍ．蛋白Ｍａｒｋｅｒ；Ａ１．結(jié)構(gòu)蛋白ＦｃＨ９；Ｂ１．結(jié)構(gòu)蛋白ＨＮ和Ｍ；Ｂ２．純Ｍ蛋白ＶＬＰ對(duì)照１２４０中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７
【作者單位】： 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472195,31402195) 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201303033)
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 袁乾亮;錢晶;薛聰;穆昱;丁壯;;基因Ⅶ型新城疫病毒樣顆粒的制備與鑒定[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2016年01期

2 張曉鵬;秦紅麗;;陳化蘭研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn):H9N2亞型禽流感病毒蘊(yùn)藏公共衛(wèi)生威脅[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2015年08期

3 丁壯;尹仁福;薛聰;王建忠;錢晶;;新城疫流行病學(xué)新特點(diǎn)及鵝新城疫防控策略[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年01期

4 郭鑫;;蛋雞養(yǎng)殖中應(yīng)注意的問題及建議[J];中國畜禽種業(yè);2014年06期

5 魯會(huì)軍;金擴(kuò)世;金寧一;;新城疫病毒變異、進(jìn)化與跨種感染[J];中國家禽;2010年07期

6 沈蕊華;禽流感病毒[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2002年05期

7 陳化蘭;于康震;盧景良;;禽流感病毒及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];國外獸醫(yī)學(xué)-畜禽傳染病;1997年01期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 秦嶺松;錢晶;徐小洪;丁佳欣;李金斗;尹仁福;丁壯;;嵌合NDV-HA病毒樣顆粒的制備與鑒定[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2017年07期

2 齊甜銘;趙文鈞;陳玉秋;孫軍峰;馬得瑩;;HN蛋白攜帶TC標(biāo)簽的重組新城疫病毒的構(gòu)建及鑒定[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2017年06期

3 蘇琪;李小麗;;西安市雞新城疫免疫抗體水平調(diào)查與分析[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年06期

4 孫朋;;基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及免疫效力研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年06期

5 李金斗;錢晶;丁佳欣;徐小洪;秦嶺松;黃蕾;武淑婷;丁偉;尹仁福;丁壯;;GPI錨定蛋白介導(dǎo)嵌合新城疫病毒樣顆粒的組裝[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2017年06期

6 程幫照;楊金兵;盧運(yùn)戰(zhàn);諸亞平;趙宏波;劉鵬義;;內(nèi)含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒樣顆粒作為熒光定量RT-PCR內(nèi)標(biāo)的制備與鑒定[J];畜牧與獸醫(yī);2017年06期

7 王華夏;顧峰;廖瑛;茅翔;丁鏟;范紅結(jié);;新城疫病毒感染通過蛋白激酶激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)干擾素和炎癥因子的表達(dá)[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2017年03期

8 胡焱;嵇辛勤;阮涌;趙佳福;雷云;段志強(qiáng);劉秀梵;;不同新城疫疫苗對(duì)貴州三穗麻鴨的免疫效果比較[J];中國獸藥雜志;2017年05期

9 蔡靜;黃瀠藝;劉俊顯;徐囡;吳長德;;雞新城疫流行原因分析及防控[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年04期

10 張濟(jì)培;譚華龍;陳岡;曾強(qiáng);張福英;陳建紅;;一株鴨源禽Ⅰ型副黏病毒毒力測定及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年04期

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 丁壯;尹仁福;薛聰;王建忠;錢晶;;新城疫流行病學(xué)新特點(diǎn)及鵝新城疫防控策略[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年01期

2 王玨;仇旭升;戴亞斌;于圣青;丁鏟;秦愛建;;華東地區(qū)健康水禽攜帶新城疫病毒情況調(diào)查[J];中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2013年06期

3 許宗麗;謝芝勛;謝麗基;劉加波;鄧顯文;謝志勤;龐耀珊;范晴;羅思思;;一株鴨源基因Ⅸ型新城疫病毒廣西分離株的生物學(xué)特性及全基因序列分析[J];中國動(dòng)物檢疫;2013年11期

4 丁鏟;;新城疫病毒毒力的進(jìn)化規(guī)律[J];中國家禽;2011年19期

5 賀文美;韋平;;感染水禽的新城疫病毒特性及其預(yù)防控制[J];廣西畜牧獸醫(yī);2011年04期

6 劉華雷;孫軍峰;趙云玲;張維;管峰;劉文華;鄭東霞;李金明;王志亮;;Ⅰ類新城疫病毒分離株NDV08-046的基因組特性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年05期

7 馮新;宋戰(zhàn)昀;劉陽;張瓊;姜永莉;丁壯;;鵝源副黏病毒融合蛋白在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年09期

8 馮新;宋戰(zhàn)昀;韓文瑜;丁壯;;新城疫病毒受體在不同動(dòng)物細(xì)胞上的分布比較[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年09期

9 孫杰;刁有祥;李建俠;吳煥榮;顏

本文編號(hào)：2552500