【摘要】：新城疫和禽流感是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的兩大動物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是當(dāng)前的主要優(yōu)勢流行株。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白裝配而成的空心顆粒,不攜帶核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本試驗將AIV HA胞外域與NDV F基因胞內(nèi)、跨膜域融合構(gòu)建FcH9融合序列;進(jìn)一步通過利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有FcH9序列的重組桿狀病毒rBV-FcH9,與實驗室已構(gòu)建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9細(xì)胞,收集感染細(xì)胞上清,經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化嵌合VLPs。血凝血抑試驗結(jié)果顯示嵌合VLPs中HN和HA效價均為28;Western blot分析表明該VLPs可以與特異性陽性血清發(fā)生反應(yīng);透射電鏡觀察該VLPs具有典型的病毒粒子結(jié)構(gòu)正,形態(tài)大小與野生型NDV相似。結(jié)果表明:本試驗成功制備了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,為研制新型NDV-AIV二聯(lián)疫苗候選株奠定基礎(chǔ),并為當(dāng)前新城疫與H9N2亞型禽流感的防控提供策略。
【圖文】：

Ｈ９陽性血清各２５μＬ連續(xù)倍比稀釋（對照組不加血清），之后每孔滴加２５μＬＶＬＰｓ在３７℃孵育４５ｍｉｎ。最后每孔滴加２５μＬ１％雞紅細(xì)胞，冰上孵育３０ｍｉｎ后判定血凝效價。２結(jié)果２．１目的基因的擴增與連接利用特異性引物，以ＦｃＤＮＡ和ＨＡｃＤＮＡ為模板，成功擴增出Ｆ基因的胞內(nèi)域和跨膜域及ＨＡ的胞外域。擴增產(chǎn)物利用特異性引物經(jīng)重疊延伸ＰＣＲ連接獲得ＦｃＨ９片段（１７５５ｂｐ），片段大小與預(yù)期相符（圖１）。圖１ＦｃＨ９嵌合基因重疊延伸ＰＣＲ擴增Ｍ．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～５．ＦｃＨ９片段２．２重組桿狀病毒基因組的鑒定以Ｐ３代ｒＢＶ－ＦｃＨ９基因組為模板，分別用Ｍ１３引物和特異性引物進(jìn)行ＰＣＲ擴增，，可見４０５０ｂｐ左右的條帶和１２３９中國獸醫(yī)學(xué)報２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７

１７５０ｂｐ左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖２Ａ，Ｂ）。圖２重組桿狀病毒ＰＣＲ鑒定Ｍ１．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ａ１～Ａ４．重組桿狀病毒基因組Ｍ１３引物的ＰＣＲ產(chǎn)物；Ｍ２．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｂ１、Ｂ２．特異性引物ＰＣＲ產(chǎn)物２．３Ｓｆ９細(xì)胞病變觀察重組桿狀病毒共感染后可見Ｓｆ９細(xì)胞變大，內(nèi)部顆�；兴槠纬�，并逐漸脫落（圖３Ａ），圖３Ｂ為未接毒Ｓｆ９細(xì)胞。圖３Ｓｆ９細(xì)胞電鏡觀察Ａ．正常Ｓｆ９；Ｂ．病變Ｓｆ９２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測與鑒定將純化的ｃＶＬＰｓ進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測，使用Ｈ９陽性血清為一抗，結(jié)果可見在７５０００處出現(xiàn)目的條帶（圖４Ａ）；以ＮＤ陽性血清為一抗，結(jié)果可見與預(yù)期相符的條帶，ＨＮ蛋白大小約為７００００，Ｍ蛋白約４００００（圖４Ｂ）。圖４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定圖Ｍ．蛋白Ｍａｒｋｅｒ；Ａ１．結(jié)構(gòu)蛋白ＦｃＨ９；Ｂ１．結(jié)構(gòu)蛋白ＨＮ和Ｍ；Ｂ２．純Ｍ蛋白ＶＬＰ對照１２４０中國獸醫(yī)學(xué)報２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７
【作者單位】： 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(31472195,31402195) 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項資助項目(201303033)
【分類號】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2552500