【摘要】：本試驗(yàn)旨在應(yīng)用細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型、蛋白免疫印跡(Western Blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)等技術(shù)手段,從細(xì)胞和分子水平探究嗜酸乳桿菌與仔豬小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激之間的內(nèi)在關(guān)系及闡明NF-κB信號(hào)通路在仔豬小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的介導(dǎo)作用。研究結(jié)果將為揭示嗜酸乳桿菌調(diào)控仔豬小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制提供理論依據(jù),并為嗜酸乳桿菌在仔豬飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。所得出在結(jié)果如下:(1)細(xì)胞存活率隨著H_2O_2濃度的增加而降低,H_2O_2濃度處于1.2~1.8 mM時(shí),細(xì)胞的存活率雖然有所下降但差異不顯著(P0.05),此時(shí)其存活率為60%左右。細(xì)胞上清液SOD、GSH-Px、CAT活力隨著H_2O_2作用濃度升高,SOD、GSH-Px、CAT活性顯著下降(P0.05),MDA差異不顯著。細(xì)胞內(nèi)MDA含量隨著H_2O_2濃度的升高而顯著降低(P0.05),SOD、GSH-Px、CAT差異不顯著。以上結(jié)果提示:1.2 mM的H_2O_2能造成IPEC-J2細(xì)胞的氧化應(yīng)激,可以作為構(gòu)建體外細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的終濃度。(2)正常條件下細(xì)胞活力隨著嗜酸乳桿菌濃度的增加而上升。氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-J2細(xì)胞活力也隨著嗜酸乳桿菌濃度的增加而逐漸上升,當(dāng)菌濃度大于1.0×108CFU·m L-1時(shí),細(xì)胞的存活率超過對(duì)照組;當(dāng)嗜酸乳桿菌濃度大于1.0×109 CFU·m L-1時(shí),細(xì)胞存活力差異不顯著(P0.05)。細(xì)胞上清液中各組中SOD、GSH-Px活力存在顯著差異,而CAT活力差異不顯著。細(xì)胞內(nèi)MDA含量存在顯著差異。其中,隨著嗜酸乳桿菌作用濃度升高,SOD、GSH-Px活性顯著增加(P0.05),MDA含量顯著降低(P0.05)。添加了嗜酸乳桿菌組中,細(xì)胞漿內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和過氧化氫組(P0.05)。過氧化氫組高于對(duì)照組,但差異不顯著。(3)過氧化氫能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)磷酸化IκBα。嗜酸乳桿菌預(yù)處理后,P-IκBα蛋白顯著下降。Bay抑制劑則能逆轉(zhuǎn)這種下降。嗜酸乳桿菌能顯著提高細(xì)胞內(nèi)磷酸化NF-κB蛋白的表達(dá)量(P0.05)。嗜酸乳桿菌可以顯著地提高細(xì)胞內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)(P0.05)。三種抑制劑均能顯著地抑制細(xì)胞內(nèi)TLR2蛋白的表達(dá)(P0.05)。嗜酸乳桿菌能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)IL-1β蛋白的表達(dá)(P0.05)。PDTC、Bay、小白菊內(nèi)酯預(yù)處理均能抑制這種高表達(dá)(P0.05)。與對(duì)照組相比,過氧化氫和嗜酸乳桿菌都能提高細(xì)胞內(nèi)Myd88 mRNA的表達(dá)(P0.05)。與嗜酸乳桿菌組相比,Bay抑制劑預(yù)處理后能下調(diào)Myd88 mRNA的表達(dá),PDTC預(yù)處理組反而顯著增強(qiáng)了該基因的表達(dá),小白菊內(nèi)酯差異性不顯著。與對(duì)照組相比,其余各組TLR2、TLR3mRNA表達(dá)顯著下降,其余各組間差異性不顯著。與對(duì)照組、過氧化氫組和嗜酸乳桿菌組相比,PDTC和小白菊內(nèi)酯組均能顯著下調(diào)TLR4 mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比,過氧化氫組、bay抑制劑組和小白菊內(nèi)酯組均顯著下調(diào)p65 mRNA的表達(dá)量,而嗜酸乳桿菌組和嗜酸乳桿菌預(yù)處理組顯著增強(qiáng)p65 mRNA的表達(dá)(P0.05)。與對(duì)照組相比,過氧化氫組、嗜酸乳桿菌組以及bay預(yù)處理組均顯著提高IKKβmRNA相對(duì)表達(dá)量(P0.05)。其余各組與對(duì)照組相比,IκBαmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降。其余各組差異不顯著。過氧化氫能夠顯著提高腫瘤壞死因子的表達(dá),嗜酸乳桿菌預(yù)處理能顯著下調(diào)腫瘤壞死因子的高表達(dá)(P0.05)。嗜酸乳桿菌顯著提高IL-1β、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P0.05)。bay和小白菊內(nèi)酯抑制劑能顯著減緩這種高表達(dá)(P0.05)。綜和以上結(jié)果,我們可以得出:1.2 mM的H_2O_2能造成IPEC-J2細(xì)胞的氧化應(yīng)激,可以作為本試驗(yàn)構(gòu)建體外細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的終濃度。嗜酸乳桿菌能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長,增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化水平,降低胞漿內(nèi)緊密連接蛋白的表達(dá)量。嗜酸乳桿菌預(yù)處理能顯著下調(diào)TNF-α等細(xì)胞因子的高表達(dá),減緩過氧化氫誘導(dǎo)IKK的表達(dá),在一定程度上抑制NF-κB信號(hào)通路的發(fā)生。
【圖文】：

圖 2.1 H2O2對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞活力的影響Fig. 2.1 Effect of H2O2on cellular activity of IPEC-J2 cells2O2對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞上清液中 MDA 含量及抗氧化水平的影由表 2.1 所知，細(xì)胞上清液中各組中 SOD、GSH-Px、CAT 活力存在顯著DA 含量差異不顯著。其中，隨著 H2O2作用濃度升高，SOD、GSH-Px、著下降（P<0.05）。當(dāng) H2O2作用濃度為 1.2 mM，SOD 活力顯著低于對(duì)照1.0 mM，且 1.4、1.6、1.8、2.0 mM 組與之差異不顯著（P>0.05）。表 2.1 H2O2對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞上清液中 MDA 含量及抗氧化水平的影響able 2.1 effect of H2O2on MDA content and antioxidant activity in IPEC-J2 cell supern度 concentration/丙二醛MDA/（nmol/mg prot）超氧化物歧化酶SOD/（IU/ mg prot）谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px/（IU/ mg prot）（6.23±1.048 32.14±3.589a6.73±2.020a7.71±1.767 28.58±5.525a5.39±0.284ab6.58±0.511 21.90±1.756b5.28±0.315ab

目的蛋白電泳及 Western-blot具體試驗(yàn)步驟按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理仔豬上皮細(xì)胞活力以 MTT 法測(cè)出 OD 值計(jì)算，相關(guān)蛋白表達(dá)量以“樣本蛋÷同一樣本 GAPDH 灰度值”計(jì)算。采用 SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析進(jìn)行多重比較。P<0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果與分析 嗜酸乳桿菌對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞活力的影響由圖 2.2 可知，，當(dāng)嗜酸乳桿菌濃度小于 1.0×109CFU·mL-1時(shí)，隨著嗜酸乳的增加，細(xì)胞活力隨有增加但差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)菌濃度大于 U·mL-1時(shí)，細(xì)胞的存活力顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；當(dāng)嗜酸乳桿菌濃度大于U·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活力差異不顯著（P>0.05）。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2552060