【摘要】：本實驗以湖羊為研究對象。首先,利用q-PCR技術(shù)對湖羊Smads基因在出生后不同生長階段、不同性別、不同骨骼肌(背最長肌、比目魚肌、腓腸肌、趾長伸肌)的相對表達(dá)進(jìn)行了分析。其次,利用膠原酶和胰酶聯(lián)合消化法,成功從湖羊肌肉組織中分離出了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,并采用差速貼壁法對其進(jìn)行了純化,所得細(xì)胞生長狀態(tài)良好,純度較高,低血清誘導(dǎo)后可以分化成肌管。最后,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,在湖羊肌衛(wèi)星細(xì)胞中對YAP1進(jìn)行了過表達(dá)后相關(guān)研究。初步探討Hippo-YAP1通路參與調(diào)控湖羊肌肉生長、發(fā)育的機(jī)理。本研究獲得了以下結(jié)果：1. Smads基因在湖羊背最長肌中的表達(dá)量均低于其他肌肉組織；Smad2、Smad3、Smad4基因均在二日齡的表達(dá)量最高,Smad7基因在六月齡時表達(dá)量最高；Smad2、Smad3、Smad4基因在二日齡公羊中的表達(dá)量高于母羊,六月齡則低于母羊；2.在四種不同肌肉組織中,Smad2與Smad3, Smad3與Smad4均存在極顯著正相關(guān)(P0.01),體現(xiàn)了其共同對TGF-β/smad信號通路的抑制作用。YAP1與MSTN間均存在極顯著正相關(guān)(P0.01),進(jìn)一步說明了YAP1可能通過參與調(diào)控TGF-β/smad通路活性而參與肌肉的增殖和分化過程；3.成功從湖羊肌肉組織中分離出了肌衛(wèi)星細(xì)胞。并采用差速貼壁法對其進(jìn)行了純化。所得細(xì)胞生長狀態(tài)良好,純度較高,低血清誘導(dǎo)后可以分化成肌管。Q-PCR結(jié)果表明在湖羊肌衛(wèi)星細(xì)胞大量分化為肌管的過程中,YAP1與MyoG基因的表達(dá)量表現(xiàn)出明顯增加的趨勢,MSTN則降低；4.過表達(dá)YAP1-Ser42Ala基因能夠促進(jìn)湖羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,但在48h內(nèi)未能達(dá)到顯著差異水平。對YAP1基因過表后,發(fā)現(xiàn)MSTN表達(dá)量降低,而MyoG、mad3、Smad4、 Smad7、Lats1基因表達(dá)量則增加,其中Smad3基因表達(dá)量差異極顯著(P0.01),其它差異均不顯著。
【圖文】：

采用連續(xù)２－３代差速貼壁純化湖羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)間接免疫焚光鑒逡逑定顯示，細(xì)胞Ｐａｘ－７陽性率為（９３．６±２．３）邋％，細(xì)胞ＭｙｏＤ陽性率為（９４．４＋１．５）邋％，結(jié)逡逑果表明上述方法獲得的肌衛(wèi)星細(xì)胞達(dá)到％．５％＾上（圖３－２）。逡逑桯曲逡逑隹逡逑姦灥屼貓Ｉ國WＩ逡逑圖３－２綿羊骨骼肌：Ｒ吊細(xì)胞鑒定（１００Ｘ）逡逑Ｆｉｇ邋３－２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｈｅｅｐ邋ｓｋｅｌｅｔａｌ邋ｍｕｓｃｌｅ邋ｓａｔｅｌｌｉ化邋ｃｅｌｌｓ邋（１０0ｘ）逡逑Ａ：邋Ｐａｘ－７；邋Ｂ：邋ＭｙｏＤ．逡逑２．３湖羊肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化逡逑在用２％ＨＳ誘導(dǎo)分化過程中，湖羊肌衛(wèi)星細(xì)胞在０－ｌｄ時細(xì)胞增殖很快，，形態(tài)上無明顯逡逑變化；繼續(xù)分化培養(yǎng)時細(xì)胞開始延伸變長，２－３ｄ可見少數(shù)細(xì)胞開始融合形成短小的肌管；逡逑

邐邋３７逡逑２．５成肌分化過程肌相關(guān)ｍＲＮＡ分子表達(dá)情況逡逑由圖３－５可Ｗ看出，隨著誘導(dǎo)分化時間的延長，ＹＡＰ１基因的表達(dá)量逐漸增加，第一天逡逑與第Ｈ天的表達(dá)量存在顯著性差異（戶＜0．0５），與第五天存在著極顯著差異（尸＜0．0１）；而逡逑ＭＳＴＮ基因則隨著誘導(dǎo)時間的推移有遞減的趨勢，第一天與第＝天和第五天均表達(dá)量存在逡逑極顯著關(guān)系（ｉ＾Ｏ．Ｏｌ），第Ｈ天與第五天差異不顯著（Ｐ＞0．0５）；邋ＭｙｏＧ基因則先增加后降逡逑低，第Ｈ天和第五天較第一天表達(dá)量顯著增加存在顯著或極顯著差異（ｆ＜0．0５）。逡逑５邐１邐Ａａ邐＂ｄ逡逑Ａ邋４．５邐－邐１邋ｇ％逡逑＜邐４邐－邐自口邋３ｄ逡逑ｉ＇－３：逡逑Ｉ邋－邐Ａ褲邐W逡逑Ｓ邋＇邋Ａａｊｙ邐Ａａ邐Ｂｅｌ逡逑馨。ｊ；ＪＩ邐ｆａｙｒｉ逡逑ｕ邋？邐Ｉ邐—－邐Ｉ邐Ｉ逡逑ＹＡＰＩ邐ＭＳＴＮ邐ＭｙｏＧ逡逑基因逡逑圖３－５基因表達(dá)量變化趨勢逡逑Ｆｉｇ邋３－５．Ｔｈｅ邋ｔｒｅｎｄ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑注：Ａ邋（ａ）、Ｂ邋（ｂ）、Ｃ邋（ｃ）系列的字母表示的是誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞不同天數(shù)間的多重比較結(jié)果；相逡逑同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａ，邋Ｂ，邋Ｃ，邋ａ，邋ｂ，邋Ｃ邋ｓｈｏｗ邋ｔｈｅ邋化５山ｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄａｙｓ．邋Ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ａｒｅ邋ｎｏ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅ化ｎｔ邋（b6＞０．０５）
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

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本文編號：2550463