發(fā)布時(shí)間：2019-10-17 01:43

【摘要】：為了研究瘦素對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖分化的影響,本試驗(yàn)以ATDC5細(xì)胞作為軟骨細(xì)胞模型,分別采用0 ng/m L(對(duì)照組)、10 ng/m L、100 ng/mL三種不同濃度的瘦素刺激ATDC5細(xì)胞。在ATDC5細(xì)胞培養(yǎng)14 d時(shí),進(jìn)行阿利新藍(lán)蛋白聚糖染色,采用RT-PCR法檢測(cè)Ⅱ型膠原、Sox9、Aggrecan基因的相對(duì)表達(dá)量,用Western blot法檢測(cè)Sox9及Aggrecan的蛋白相對(duì)表達(dá)量;21 d時(shí),進(jìn)行茜紅S鈣化結(jié)節(jié)染色,采用RT-PCR法檢測(cè)Ⅹ型膠原mRNA的表達(dá)量,Western blot法檢測(cè)Ⅹ型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量,在此之后檢測(cè)瘦素對(duì)堿性磷酸酶活性的影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:阿利新藍(lán)染色后,各組之間并無肉眼可見的差異,不足以證明瘦素對(duì)蛋白聚糖分泌量的影響;茜紅鈣化結(jié)節(jié)染色后,通過檢查結(jié)節(jié)數(shù)量的多少發(fā)現(xiàn),隨著瘦素濃度增加鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少。通過基因與蛋白水平的進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Sox9 m RNA表達(dá)量隨著瘦素濃度的增加呈下降趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間相比差異極顯著(P0.01),兩實(shí)驗(yàn)組間相比差異極顯著(P0.01);其蛋白的相對(duì)表達(dá)量在瘦素濃度為10 ng/m L和100 ng/m L時(shí)均呈上升趨勢(shì),與對(duì)照組相比差異極顯著(P0.01);隨著瘦素濃度增高,Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量在瘦素濃度為10 ng/m L時(shí)有所增加,與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),瘦素濃度為100ng/m L時(shí)表達(dá)量下降。與對(duì)照組無差異(P0.05),與10 ng/m L組相比差異顯著(P0.05);與對(duì)照組相比,隨瘦素濃度增加,Aggrecan m RNA表達(dá)量呈下降趨勢(shì),瘦素濃度為10 ng/m L時(shí),基因表達(dá)量與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),瘦素濃度為100 ng/m L時(shí),mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比,差異極顯著(P0.01),兩個(gè)加瘦素的實(shí)驗(yàn)組相比,差異極顯著(P0.01),其蛋白表達(dá)量與基因的表達(dá)趨勢(shì)一致,也隨瘦素濃度的增加而下降,100 ng/m L組與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),其它均無差異(P0.05),以上結(jié)果表明,瘦素濃度的增加會(huì)抑制Sox9基因的表達(dá),但其蛋白的表達(dá)量反而增加。在一定范圍內(nèi),瘦素濃度的增加會(huì)促進(jìn)Ⅱ型膠原,但瘦素濃度超過一定范圍,Ⅱ型膠原的分泌量便會(huì)下降;較高濃度的瘦素會(huì)抑制Aggrecan基因以及蛋白的表達(dá);Sox9可以增強(qiáng)Ⅱ型膠原與Aggrecan啟動(dòng)子的活性,而瘦素下調(diào)了Sox9的基因表達(dá)量,因此Ⅱ型膠原與Aggrecan的表達(dá)量下降。與對(duì)照組相比,Ⅹ型膠原mRNA表達(dá)量隨著瘦素濃度的增加顯著上升,瘦素濃度為10 ng/m L時(shí),與對(duì)照組之間無差異(P0.05),瘦素濃度為100 ng/m L時(shí),其mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯增加,與對(duì)照相比差異極顯著(P0.01),與10 ng/m L組相比差異極顯著(P0.01);Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)量在瘦素濃度為10 ng/m L和100 ng/m L時(shí)均顯著上升,且兩實(shí)驗(yàn)組組之間差異極顯著(P0.01),且兩實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P0.01);堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為:ALP活性隨著瘦素濃度的增加而增強(qiáng)。軟骨細(xì)胞分化后期會(huì)發(fā)生肥大,分泌Ⅹ型膠原,瘦素濃度增加會(huì)促進(jìn)Ⅹ型膠原的分泌,抑制鈣化,堿性磷酸酶活性增強(qiáng)。Ⅱ型膠原、Sox9、Aggrecan、Ⅹ型膠原以及堿性磷酸酶是細(xì)胞增殖分化的不同階段所分泌的不同標(biāo)志性因子,存在于細(xì)胞外基質(zhì)中,這些因子的變化會(huì)反映出整個(gè)骨關(guān)節(jié)的狀態(tài)。本試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明,一定濃度的瘦素會(huì)抑制ATDC5細(xì)胞的增殖分化。正常的軟骨組織組織中瘦素含量很低,本實(shí)驗(yàn)供給的外源性瘦素,相當(dāng)于較高濃度的瘦素水平。因此,本試驗(yàn)認(rèn)為瘦素濃度的增加會(huì)在一定程度上抑制ATDC5細(xì)胞的增殖分化,且濃度越高作用越強(qiáng),瘦素水平較高,細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞長(zhǎng)期處于肥大階段,鈣化作用受阻,導(dǎo)致骨形成障礙。
【圖文】：

P<0.05，**表示差異極5，##表示 100 ng/mL 與 10 ta compared with control ly significant, P<0.01; # repextremely significant differenc圖 3-1 CCK8 細(xì)胞活性3-1 Detection of CCK8 ce測(cè)結(jié)果 RNA測(cè)定發(fā)現(xiàn)，OD260取的樣品總 RNA 濃度可發(fā)現(xiàn)，，清晰可見 28 S、1解。

圖 3-3 阿利新藍(lán)染色結(jié)果Fig.3-3 The results of Alcian blue staining如圖 3-4 所示，隨著瘦素濃度的增加，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，說明隨著瘦素濃度的增加，鈣化作用減弱。圖 3-4 茜紅染色結(jié)果Fig.3-4 The results of alizarin red staining3.4 瘦素對(duì) ALP 活性的影響如表 3-5 所示，加入瘦素后，與對(duì)照組相比較，在瘦素濃度為 10 ng/mL 時(shí)，堿性磷酸活性上升，差異顯著（P<0.05）；瘦素濃度為 100 ng/mL 時(shí)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2550298