【摘要】：鴨病毒性腸炎(DVE,Duck viral enteritis),也稱為鴨瘟(Duck plague),是由鴨腸炎病毒(DEV,Duck Enteritis Virus)引發(fā)的會致使鴨、鵝和多種雁形目禽類的急性、敗血性、傳染性的一種致命疾病。該病在我國屬于三類疫病,是當(dāng)前威脅養(yǎng)鴨業(yè)進(jìn)步的重要疫病之一,其特點主要為傳播迅速、發(fā)病率以及死亡率高、流行廣泛。本研究制備3株針對鴨瘟病毒全病毒的單克隆抗體,初步建立抗原檢測方法。同時對DEV VAC株種毒擴(kuò)增并針對其制備鴨多抗血清,通過對所制備的抗原抗體的一系列標(biāo)定后,獲取DEV的標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清。1.抗鴨瘟病毒單克隆抗體的制備及間接免疫熒光檢測方法建立本研究將DEV VAC株通過SPF鴨胚擴(kuò)增并對其進(jìn)行純化,將其作為免疫原免疫BABL/c小鼠進(jìn)行單克隆抗體的制備,采用優(yōu)化后的間接免疫熒光檢測辦法,對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行兩次篩選和四次亞克隆后,獲得三株能夠分泌DEV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為DEV-5H10、DEV-4H11、DEV-6D8,經(jīng)亞類鑒定后判定DEV-5H10和DEV-6D8為IgG2b型單克隆抗體,DEV-4H11為IgM抗體,經(jīng)Western-blot分析后,DEV-5H10和DEV-6D8能夠與DEV VAC株反應(yīng)出現(xiàn)69KDa大小的特異性條帶,其腹水效價分別為1:1600以及1:3200。以單克隆抗體DEV-6D8為一抗,FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗,一抗、二抗孵育時間均為30min建立間接免疫熒光方法以檢測病毒抗原,該方法最低可檢測到1-10個TCID50感染的細(xì)胞病毒,對臨床鴨瘟病毒的診斷具有重要意義。2.鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備本研究通過SPF鴨胚對DEV VAC株種毒進(jìn)行擴(kuò)增,并對所收集的病毒液進(jìn)行病毒含量的測定,結(jié)果顯示該病毒液TCID50=10-4.8/0.1mL,通過Western-blot鑒定、中和試驗、血凝試驗、PCR特異性分析進(jìn)一步鑒定,表明該病毒液中無DHV(鴨病毒性肝炎)、GPV(小鵝瘟)、EDS(產(chǎn)蛋下降綜合征)、IBDV(傳染性法氏囊病)、REV(網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生)、REOV(呼腸孤病毒)、新城疫病毒(NDV)、禽流感(AIV)等外源病毒污染。通過無菌檢驗以及支原體檢測,證明該病毒液未被細(xì)菌、支原體污染。在經(jīng)一系列標(biāo)定后的DEV全病毒抗原中添加1%BSA凍存保護(hù)劑,對其分裝、凍干,再經(jīng)物理性狀檢查、CV值測算、均一性、穩(wěn)定性、保質(zhì)期等檢驗后獲得DEV標(biāo)準(zhǔn)抗原。對禽類生物制品質(zhì)量控制和效力評估具有重要的意義。3.鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的制備使用DEV VAC株病毒對SPF鴨進(jìn)行免疫,制備DEV多抗血清,采用本實驗所建立的間接免疫熒光抗體檢測辦法檢測其IFA效價為1:27,對其進(jìn)行微量細(xì)胞中和試驗,測算其中和效價為1:58。利用間接免疫熒光實驗以及血凝抑制試驗鑒定該多抗血清的特異性及純異性,證明該血清只與DEV反應(yīng)而與GPV(小鵝瘟)、EDS(產(chǎn)蛋下降綜合征)、IBDV(傳染性法氏囊病)、REV(網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生)等病毒沒有交叉反應(yīng)現(xiàn)象,通過無菌檢驗以及支原體檢測,證明該血清未被細(xì)菌、支原體污染。在經(jīng)一系列標(biāo)定后的鴨多抗血清中添加萬分之一的硫柳汞防腐劑,進(jìn)行分裝以及凍干,再經(jīng)物理性狀檢查、CV值測算、均一性檢測、穩(wěn)定性測試、保質(zhì)期檢測等檢驗后得到DEV標(biāo)準(zhǔn)血清。對禽類生物制品質(zhì)量控制和效力評估具有重要的意義。
【圖文】：

后出現(xiàn)鴨瘟病毒所有的特征病變在自然或?qū)嶒灨腥竞�，幾種水禽（綠頭鴨逡逑Ｍａｌｌａｒｄｓ，美國黑鴨邋Ａｍｅｒｉｃａｎ邋Ｂｌａｃｋ邋Ｄｕｃｋｓ，北方針尾鴨邋Ｎｏｒｔｈｅｒｎ邋Ｐｉｎｔａｉｌ）的舌下逡逑唾液腺孔附近可發(fā)現(xiàn)口腔糜爛（圖１．Ａ）。發(fā)病綠頭鴨的食管出現(xiàn)局灶性出血．及逡逑壞死［２５］，表面覆蓋有壞死上皮細(xì)胞構(gòu)成的黃色假膜（圖１．Ｂ）。食管腺胃交界處、逡逑大腸粘膜表面（圖１．Ｃ），以及腸道環(huán)狀帶可能會出現(xiàn)出血和壞死。成年雌鴨可逡逑能在卵巢中出現(xiàn)廣泛性出血以及體腔出血。通常出血和壞死部位為泄殖腔，肝臟逡逑和心臟（圖１．Ｄ，，圖１．Ｅ）。其他野生水禽物種上的病理變化有很多不同之處。逡逑最常見的病變一般有食道中的壞死性病變，環(huán)狀帶出血及壞死。心外膜、肝、脾、逡逑胰腺表面的點狀出血和局灶性壞死［２６］。在不同物種上病理變化表現(xiàn)有所不同，例逡逑如曾報道自然感染鴨瘟病毒的木鴨環(huán)狀帶有出血現(xiàn)象，但是這些病變沒有出現(xiàn)在逡逑實驗感染的禽類體內(nèi)。相反

結(jié)與討論逡逑小結(jié)逡逑本研究將ＤＥＶ邋ＶＡＣ株通過絨毛尿囊膜途徑接種ＳＰＦ鴨胚以擴(kuò)增，死胚體全身彌散性出血，肝臟有局灶性壞死，絨毛尿囊膜嚴(yán)重水腫增厚，，尿囊液減少等典型的鴨瘟病理變化對發(fā)病死亡鴨胚的絨毛尿囊破碎，其后使用梯度離心和蔗糖墊底超速離心的方式進(jìn)行病毒純化，鏡對純化的病毒進(jìn)行觀察，可觀察到清晰完整的病毒顆粒，直徑約］７膜，可見明顯的囊膜、外膜、六角形衣殼以及核心具有典型的形態(tài)。逡逑將此純化的病毒作為免疫原接種ＢＡＬＢ／ｃ小鼠進(jìn)行單克隆抗體的制備，檢測其血清的ＩＦＡ效價，選取效價最高的小鼠在融合前７２－９６ｈ加強(qiáng)免
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2549234