【摘要】：豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的一種高度接觸性傳染病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛分布,可引起種豬繁殖障礙,仔豬呼吸道綜合征、神經(jīng)癥狀、腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等主要癥狀,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái),該病繼續(xù)發(fā)生與流行,推測(cè)新的流行毒株抗原性發(fā)生較大變異,且致病力強(qiáng),現(xiàn)有的疫苗不能完全保護(hù)流行毒株的感染。因此,為有效防控該病流行,需要研制針對(duì)流行毒株的疫苗。2014年廣東某豬場(chǎng)保育仔豬大量死亡,發(fā)病癥狀與PRV感染相符。本研究對(duì)該豬場(chǎng)PRV野毒株進(jìn)行分離鑒定,并研究其致病性,為研制針對(duì)新流行毒株的疫苗奠定基礎(chǔ)。1.廣東一株豬偽狂犬病毒的分離鑒定采用PCR、非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞感染、間接免疫熒光、電鏡觀察等方法,從廣東某豬場(chǎng)疑似PRV感染的豬群中分離鑒定病毒。在處理的腦組織病料中PCR擴(kuò)增出PRV野毒株gE基因特異性產(chǎn)物,提示該豬群受PRV野毒感染。將病料上清接種Vero細(xì)胞,36h后細(xì)胞呈現(xiàn)變圓、膨脹、聚集脫落等典型細(xì)胞病變,再經(jīng)PCR檢測(cè)到gE基因特異性產(chǎn)物。將接種病毒的Vero細(xì)胞,用PRV陽(yáng)性血清進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光。將病毒液負(fù)染后,在透射電鏡下觀察到直徑為150nm左右病毒顆粒,呈球形,有囊膜,囊膜外有明顯的呈放射狀的纖突,呈現(xiàn)PRV典型的病毒顆粒。將病毒感染Vero細(xì)胞進(jìn)行滴度檢測(cè),滴度為107.25TCID50/ml。對(duì)病毒gE基因進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示該分離株與參考毒株gE基因同源性在97.5%～99.9%之間,與我國(guó)2013-2014年間新分離的強(qiáng)毒株具有相近的遺傳進(jìn)化親緣關(guān)系。上述結(jié)果表明,該豬群受PRV野毒感染,并將分離的PRV野毒命名為GDHD-1株。2.豬偽狂犬病毒分離株GDHD-1的致病性研究分別用新西蘭白兔、仔豬分析PRVGDHD-1的致病性。選用6只10周齡健康新西蘭白兔,其中2只皮下注射2ml107TCID50的病毒液,2只皮下注射2ml106TCID50的病毒液,2只對(duì)照組皮下注射2ml無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果顯示4只接種PRV GDHD-1的新西蘭白兔在攻毒24h后出現(xiàn)明顯的瘙癢和神經(jīng)癥狀,48～72h后全部死亡,且高滴度病毒攻毒組致死速度明顯快于低滴度病毒攻毒組,證實(shí)PRVGDHD-1對(duì)新西蘭白兔有致死性。將15日齡的新生健康仔豬分成3組,每組5頭。第1組滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml,第2組滴鼻接種滴度為106TCID50的病毒液2ml,第3組作為對(duì)照組滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水。接種病毒液的第1組與第2組仔豬表現(xiàn)出高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀等明顯的偽狂犬病毒感染癥狀,至第10天全部發(fā)病死亡,且高滴度病毒攻毒組致死速度明顯快于低滴度病毒攻毒組;對(duì)照組正常。將15日齡含抗PRV母源抗體的健康仔豬分3組,每組5頭。第1組通過(guò)滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml,第2組通過(guò)滴鼻接種滴度為106TCID50的病毒液2ml;第3組作對(duì)照組通過(guò)滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水。接種病毒液的第1組與第2組仔豬均表現(xiàn)出高熱、呼吸困難及神經(jīng)癥狀等偽狂犬病毒感染癥狀,至第11天全部死亡;對(duì)照組正常。另選用8日齡新生健康仔豬分3組,每組5頭。第1組免疫市售國(guó)產(chǎn)PRV弱毒活疫苗2ml,第2組免疫市售進(jìn)口的PRV弱毒活疫苗2ml,對(duì)照組接種等量無(wú)菌生理鹽水;21天后再分別對(duì)第1組和第2組進(jìn)行滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml,對(duì)照組滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果顯示:第1組在攻毒后豬出現(xiàn)高熱、嚴(yán)重呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)、倒地后四肢劃動(dòng)癥狀,第7天全部死亡;第2組表現(xiàn)出體溫升高、精神沉郁、昏睡、扎堆、咳嗽等較為緩和癥狀,第10天全部死亡;對(duì)照組正常。豬的毒力試驗(yàn)結(jié)果表明PRVGDHD-1對(duì)新生仔豬有致死性,母源抗體、選用的市售弱毒疫苗不能抵抗PRVGDHD-1的感染,證實(shí)PRVGDHD-1毒力強(qiáng)。上述研究結(jié)果為選擇合適的疫苗株,研制針對(duì)新流行毒株的疫苗奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

中的水痘病毒屬（Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）。完整的病毒粒子呈圓形或球形，擁有囊膜，直徑約逡逑為１５０ｎｍ￣１８０ｍｎ，該病毒是典型的雙鏈ＤＮＡ病毒，成熟的病毒粒子結(jié)構(gòu)分為核忘、逡逑核衣殼、包膜，其中包膜又分為皮層和囊膜，如圖１．１所示Ｗ。該病毒的核忘由線狀逡逑雙股ＤＮＡ與一些蛋白組成核衣殼由殼粒按照一定的排列順序組成，一般呈正十逡逑二面體，，直徑約為１０５ｎｍ？ｌｌＯｎｍ；核衣殼外覆蓋的為厚薄不均的皮層結(jié)構(gòu)，皮層結(jié)構(gòu)逡逑在負(fù)染條件下一般呈現(xiàn)為纖維樣狀態(tài)，在Ｗ超薄切片觀察時(shí)是無(wú)定形的物質(zhì)；最外層逡逑的結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)雙層的囊膜，囊膜上面分布有突起。逡逑圖１．１邋ＰＲＶ病毒結(jié)構(gòu)模式圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋化ｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｉｄｅｏｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋Ｐ民Ｖ邋ｖｉｒｉｏｎ邋［叫逡逑２偽狂犬病毒基因組特征逡逑由于在瘡疹病毒科的病毒基因組里有一種基因共線性的排列方式，而且這種方式逡逑２逡逑

圖２．７邋ＰＲＶ邋ＧＤＨＤ－１株班基因的恅傳進(jìn)化關(guān)系樹逡逑?
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2548818