【摘要】：許多植物多糖已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的生物活性,研究表明蘋果多糖(Malus pumila polysaccharide)是由許多相同或不同單糖連接而成的多聚物化合物,具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、減緩疲勞等多方面生物活性,但目前關(guān)于蘋果多糖對(duì)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用的研究較少。本研究采用MTT比色法檢測不同濃度蘋果多糖對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞活力的影響;應(yīng)用Agilent SurePrint G3 Mouse GE V2.0(8*60K,Design ID:074809)基因表達(dá)譜芯片研究蘋果多糖對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)8個(gè)基因表達(dá)譜芯片分析篩選出的差異基因進(jìn)行了定量分析;采用Western Blot技術(shù)研究了蘋果多糖對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞iNOS,p105等蛋白表達(dá)的影響;同時(shí)應(yīng)用微量法NO檢測試劑盒測定了蘋果多糖對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響。以期探究蘋果多糖對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.蘋果多糖溶液濃度在20-80μg/m L時(shí),對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用,而當(dāng)蘋果多糖溶液濃度高于或等于160μg/m L時(shí),對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用;2.基因表達(dá)譜芯片掃描數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)分析后篩選出1597個(gè)差異基因(Fold Change2,p0.05),Go分析表明蘋果多糖可能通過影響RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的靶位點(diǎn),從而影響巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、天然免疫應(yīng)答以及影響巨噬細(xì)胞參與特異性免疫應(yīng)答和病毒防御過程;3.KEGG Pathway分析結(jié)果表明,蘋果多糖能通過RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞表面相關(guān)受體影響TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而激活巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能,促進(jìn)參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子或趨化因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),從而發(fā)揮其對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)8個(gè)與TNF、NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果全部吻合,證明了基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確程度和可靠性;4.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蘋果多糖能顯著提高RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)。通過檢測不同濃度蘋果多糖對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響,證實(shí)了蘋果多糖通過上調(diào)iNOS表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性。綜上所述,本研究證實(shí)了蘋果多糖可以促進(jìn)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞增殖,通過激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性,促進(jìn)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)并提高RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)量。
【圖文】：

論天然多糖已經(jīng)被證實(shí)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，例如沙蔥多糖、黃芪多糖等。同關(guān)于天然多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖的報(bào)道。本研究選取 5 個(gè)不同濃度蘋果多糖作264.7 小鼠巨噬細(xì)胞，4h 后使用 MTT 法檢測細(xì)胞活力。最終結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的正常對(duì)照組細(xì)胞相比，20-80μg/mL 蘋果多糖溶液處理過的細(xì)胞其活力p＜0.05）；蘋果多糖溶液濃度為 120μg/mL 時(shí)，其對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著的影響（蘋果多糖濃度為 160μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低（p＜0.05）。因此，蘋果多圖 2-1.不同濃度蘋果多糖對(duì) RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響與正常對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05）；**代表與正常對(duì)照組相比差異極顯著（p＜0.01）1 The influences of malus pumila polysaccharide on multiplication capacity of RAW264.7 murinemacrophage* P < 0.05, ** P < 0.01 versus control group

2.3 差異基因篩選結(jié)果對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)利用 T 檢驗(yàn)的 p 值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，總計(jì)篩選到 15個(gè)差異基因（Fold change＞3 的差異基因見附錄），其中上調(diào)基因 862 個(gè)，下調(diào)基因 個(gè)。如圖 3-2，灰色點(diǎn)為 P＞0.05 的基因，為無顯著差異基因；綠色點(diǎn)為 fold change 絕值＜2，P≤0.05 的基因，為差異倍數(shù)小于 2 的基因；紅色點(diǎn)為 Fold change≥2，P≤0.05 基因，為顯著上調(diào)差異基因；藍(lán)色點(diǎn)為 Fold change≤-2，P≤0.05 的基因，為顯著性下調(diào)異基因。其中差異表達(dá)倍數(shù)最高的 10 個(gè)基因見表 3-2。圖 3-1 基因表達(dá)譜芯片雜交掃描圖a1：實(shí)驗(yàn)組 1；a2：實(shí)驗(yàn)組 2；a3：實(shí)驗(yàn)組 3；b1：對(duì)照組 1；b2：對(duì)照組 2；b3：對(duì)照組 3Fig3-1 The scanning chart of expression profile microarraya1：test group 1；b1：test group 2；a3：test group 3；b1：control group 1；b2：control group 2；b3：control group 3
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S853.7

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本文編號(hào)：2540443