【摘要】：本論文運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)技術(shù)研究了飼糧中添加不同水平的單寧和高單寧飼糧條件下添加聚乙二醇(PEG)對(duì)綿羊和絨山羊晨飼前(Oh)以及晨飼后6h瘤胃全食糜、液相和固相附著的總細(xì)菌、厭氧真菌、3種瘤胃優(yōu)勢(shì)纖維降解細(xì)菌、3種蛋白降解細(xì)菌以及產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響；同時(shí)運(yùn)用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了晨飼前(0h)綿羊和絨山羊瘤胃全食糜中細(xì)菌多樣性的變化規(guī)律,以期從瘤胃菌群數(shù)量和多樣性的角度分析單寧對(duì)綿羊和絨山羊的抗?fàn)I養(yǎng)作用機(jī)理,從而為開發(fā)我國(guó)富含單寧的非常規(guī)飼料資源提供理論依據(jù)。本研究選用1.5-2周歲、體重45kg左右、安裝有永久性瘤胃瘺管的綿羊和絨山羊各4只。試驗(yàn)分為四個(gè)處理組,分別為試驗(yàn)Ⅰ組(對(duì)照組,即基礎(chǔ)飼糧組)、試驗(yàn)Ⅱ組(基礎(chǔ)飼糧+占基礎(chǔ)飼糧2%的單寧),試驗(yàn)Ⅲ組(基礎(chǔ)飼糧+占基礎(chǔ)飼糧6%的單寧)和試驗(yàn)Ⅳ組(基礎(chǔ)飼糧+占基礎(chǔ)飼糧6%的單寧+占基礎(chǔ)飼糧12%的PEG)。試驗(yàn)分四期進(jìn)行,每期試驗(yàn)為期30d,其中預(yù)飼期12d,正試期18d。在每期試驗(yàn)正試期第1d,分別在晨飼前(0h)晨飼后6h從試驗(yàn)動(dòng)物瘤胃腹囊中采集瘤胃內(nèi)容物,分為全食糜、固相和液相三部分,樣品于-80℃保存。提取瘤胃全食糜、固相和液相中附著微生物的粗DNA,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)測(cè)定綿羊和絨山羊瘤胃總細(xì)菌、厭氧真菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌、牛鏈球菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量；根據(jù)菌群數(shù)量的結(jié)果,提取0h綿羊和絨山羊瘤胃全食糜的粗DNA,通過(guò)16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析單寧對(duì)綿羊和絨山羊瘤胃細(xì)菌多樣性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：1)添加不同水平單寧在0h主要影響瘤胃全食糜中的菌群數(shù)量,與試驗(yàn)Ⅰ組相比,試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組瘤胃總細(xì)菌、厭氧真菌、三種纖維降解菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著降低(P0.05)；添加不同水平單寧在6h主要影響瘤胃固相內(nèi)容物中的菌群數(shù)量,其中瘤胃總細(xì)菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌數(shù)量試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組(P0.05)。2)添加PEG后,綿羊和絨山羊0h瘤胃全食糜總細(xì)菌、厭氧真菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、普雷沃氏菌、牛鏈球菌數(shù)量顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P0.05)；6h瘤胃全食糜總細(xì)菌、厭氧真菌、黃色瘤胃球菌數(shù)量和瘤胃固相產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、普雷沃氏菌、產(chǎn)甲烷菌數(shù)量試驗(yàn)Ⅳ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組(P0.05)。3)羊種之間比較發(fā)現(xiàn),Oh瘤胃全食糜厭氧真菌、黃色瘤胃球菌、牛鏈球菌、丁酸弧菌數(shù)量綿羊顯著高于絨山羊(P0.05)；6h瘤胃固相黃色瘤胃球菌、產(chǎn)甲烷菌數(shù)量山羊顯著高于綿羊(P0.05)。4)多樣性分析結(jié)果顯示,綿羊和絨山羊不同處理組瘤胃細(xì)菌菌群多樣性和豐度存在差異。兩羊種均以試驗(yàn)Ⅱ組菌群多樣性最高,Ⅰ組最低。羊種間比較發(fā)現(xiàn),綿羊各處理組菌群多樣性和豐度均高于絨山羊。5)分類學(xué)分析結(jié)果表明,各處理組綿羊和絨山羊瘤胃細(xì)菌菌群均以擬桿菌門和厚壁菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)Ⅱ組擬桿菌門相對(duì)豐度減少,厚壁菌門相對(duì)豐度增加；試驗(yàn)Ⅲ組厚壁菌門相對(duì)豐度減少,變形菌門相對(duì)豐度增加。在屬水平上,普雷沃氏菌屬是綿羊和絨山羊的優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度為13%-24%)。與對(duì)照組相比,綿羊和絨山羊試驗(yàn)Ⅱ組普雷沃氏菌屬和纖維桿菌屬相對(duì)豐度減少,腸道菌體屬相對(duì)豐度增加。
【圖文】：

２．１．２．邋３瘤胃微生物的菌液ＰＣＲ檢測(cè)逡逑目標(biāo)片段在膠回收之后進(jìn)行克隆，挑取得單克隆菌落于液體培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)逡逑夜之后，進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)，被確證為目的片段后送檢測(cè)序，菌液ＰＣＲ結(jié)果見圖７。逡逑圖７邋９種瘤胃微生物菌液ＰＣＲ檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ．７邋ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｕｍｉｎａｌ邋ｍｉｃｒｏｂｅｓ逡逑注：ａ；邋ＤＬ２０００ｍａｋｅｒ邋（ｂｐ）逡逑１、２、３；黃色癌胃巧菌、產(chǎn)班巧酸巧斤菌、白色瘤胃球菌逡逑４、５、６：邋Ｔ醇弧菌、普雷沃氏菌、牛鏈球菌邐？逡逑７、８、９；厭氧真菌、總細(xì)菌、產(chǎn)甲糕茵逡逑２．１．邋２．邋４瘤胃厭氧真菌和８種細(xì)菌陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果逡逑對(duì)陽(yáng)性克隆插入片段的進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明陽(yáng)性克隆片段與Ｇｅｎｅｎａ／邋ｂａｃｆｍ’ａ．逡逑Ａｎａｅｒｏｂｉｃ邋ｆｕｎｇｉ，邋Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ，邋Ｒ．ｃＵｂｕｓ，邋Ｒｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ，邋Ｆ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ，邋３１１巧１＾＼＞化的0逡逑彟旅ｏ／ｖｅｎｓ，邋＿Ｐｒｅｖｏｔｅ化況ｒｅｐ化ｃｏｃｃｕｓ邐的片段同源性很高，分別是９７％、１００％、逡逑９１％、９７％、９５％、９３％、９８％、９４％、１００％，且包含完整的引物序列，說(shuō)明成功構(gòu)逡逑建了有目的片斷的質(zhì)粒，該質(zhì)�？捎糜谫|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作（測(cè)序結(jié)果見附錄）。逡逑

不同的ＰＣ艮產(chǎn)物其烙解曲線也不同，從擴(kuò)增和烙解曲線可Ｗ看出是否有引物逡逑二聚體等非特異性干擾。圖１７￣２５分別為白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)哶巧酸逡逑擬桿菌、產(chǎn)甲曉菌、厭氧真菌、總細(xì)菌、普雷沃氏菌、牛鏈球菌和下酸弧菌的巧光逡逑定量ＰＣＲ擴(kuò)增和烙解曲線。從擴(kuò)增曲線圖可Ｗ看出不同處理組均檢測(cè)到了巧光信逡逑號(hào)；從溶解曲線圖可Ｗ看出，各自烙解曲線的退火溫度唯一，說(shuō)明ＰＣＲ產(chǎn)物單一，逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827;S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2539544