【摘要】：已有研究證實,綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞具有向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、肝臟細胞和成肌細胞等分化的潛能。為了建立誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的方法,本研究在構建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表達載體的基礎上,轉染至綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞進行誘導。對誘導細胞進行細胞形態(tài)學、蛋白表達以及基因表達等檢測,以期最終獲得綿羊成肌細胞。本研究中獲得結果如下：1.小鼠MyoD基因的克隆參照GenBank中的小鼠MyoD基因序列(NM_010866),采用RT-PCR擴增技術,克隆小鼠Myo D基因,將其連接到pcDNA3.1 (+)載體,獲得MyoD-pcDNA3.1真核表達載體：將獲得的MyoD-pcDNA3.1轉染到小鼠胎兒成纖維細胞中,采用Real-Time PCR、免疫熒光、流式細胞分析等進行活性檢測。其結果,MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎兒成纖維細胞中具有表達活性；2.MyoD-pcDNA3.1轉染綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞將冷凍保存的綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞復蘇培養(yǎng),當細胞達到約80%匯合時,分別進行下列處理：1)采用脂質(zhì)體轉染法將MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉染細胞,并在培養(yǎng)基中添加DMSO作為誘導劑誘導培養(yǎng)(A組)；2)采用脂質(zhì)體轉染法,轉染MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒(B組)；3)用添加有DMSO誘導劑的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(C組)。在經(jīng)上述三種處理后,分別對誘導細胞進行如下檢測：(1)細胞形態(tài)學檢測經(jīng)3種誘導處理后的第12d,在倒置熒光顯微鏡下觀察,3組細胞均由長梭形轉變成細長的成肌細胞狀態(tài),即細長管狀,旋渦狀逐漸消失。(2)免疫熒光檢測在上述各組在開始處理后的第8d,利用MyoD 和 Desmin抗體進行檢測,其結果,雖然3種處理組細胞的MyoD均呈現(xiàn)陽性表達,但與A和B組相比,C組的MyoD表達量較低；3種處理組的細胞均表達Desmin,且其表達量無明顯差別；在第16d,利用MyoD、MyoG 和 Desmin抗體進行檢測,在3種處理組的MyoD相對表達量與第8d檢測時相比均有所下降,MyoG蛋白的表達量較弱,而Desmin的表達量與第8d檢測時相比無明顯差異。(3)流式細胞檢測 采用流式細胞儀進行檢測結果,上述3種處理組的細胞均表達成肌細胞特異因子MyoD、Desmin和MyoG,且3種蛋白的陽性細胞率均達到86.6%以上(A組分別為98.6%、99.0%和99.0%；B組分別為93.5%、99.5%和97.4%；C組分別為99.3%、99.5%和86.6%)。(4) Real-Time PCR采用Real-Time PC R方法,對上述3種處理組細胞的MyoD、 MyoG和Desmin的相對表達量進行檢測,其結果,與轉染前細胞(標準化為1)相比,上述3種處理組的MyoD、MyoG和Desmin勺相對表達量與均升高(A組分別為3.217+0.01倍、4.345+0.01倍和5.107+0.01倍；B組分別為2.046±0.01倍、2.389+0.01倍和5.489+0.01倍；C組分別為3.713+0.01倍、1.861土0.01倍和5.271士0.01倍)。上述結果表明,本研究利用小鼠MyoD基因構建的MyoD-PcDNA3.1真核表達載體可以誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞為成肌細胞,為進一步研究成肌細胞對肌損傷修復的作用奠定基礎。
【圖文】：

３．３．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)逡逑將冷凍保存綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞復蘇，進行傳代培養(yǎng)。當傳代培養(yǎng)至第２代時，，逡逑呈現(xiàn)長梭形旋禍狀排列（圖３－１），對其續(xù)培養(yǎng)的第２ｄ，細胞達到約９０％Ｗ上匯合（圖逡逑３－２）。逡逑WW逡逑圖３－１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞Ｐ２（５0ｘ）邐圖３－２綿羊廝帶間充質(zhì)干細胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２綿羊驕帶間充質(zhì)干細胞的轉染及誘導分化逡逑３．３．２．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞的轉染逡逑為了檢測綿羊廝帶間充質(zhì)干細胞的轉染效率，實驗采用脂質(zhì)體轉染的方法將逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１質(zhì)粒轉染至綿羊巧帶間充干細胞，對照組為轉染ＧＦＰ質(zhì)粒的細胞，轉逡逑染２４ｈ后觀察綠色巧光的數(shù)量，Ｗ檢測和記錄轉染效率。其結果，２４ｈ后巧光倒置顯微逡逑鏡下可觀察到部分細胞發(fā)出綠色巧光（圖３－３、圖３－４），４化時巧光數(shù)量增加亮度增強逡逑（圖邋３－５、圖邋３－６）。逡逑－２９－逡逑

３．３．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)逡逑將冷凍保存綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞復蘇，進行傳代培養(yǎng)。當傳代培養(yǎng)至第２代時，逡逑呈現(xiàn)長梭形旋禍狀排列（圖３－１），對其續(xù)培養(yǎng)的第２ｄ，細胞達到約９０％Ｗ上匯合（圖逡逑３－２）。逡逑WW逡逑圖３－１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞Ｐ２（５0ｘ）邐圖３－２綿羊廝帶間充質(zhì)干細胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２綿羊驕帶間充質(zhì)干細胞的轉染及誘導分化逡逑３．３．２．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細胞的轉染逡逑為了檢測綿羊廝帶間充質(zhì)干細胞的轉染效率，實驗采用脂質(zhì)體轉染的方法將逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１質(zhì)粒轉染至綿羊巧帶間充干細胞，對照組為轉染ＧＦＰ質(zhì)粒的細胞，轉逡逑染２４ｈ后觀察綠色巧光的數(shù)量，Ｗ檢測和記錄轉染效率。其結果，２４ｈ后巧光倒置顯微逡逑鏡下可觀察到部分細胞發(fā)出綠色巧光（圖３－３、圖３－４），４化時巧光數(shù)量增加亮度增強逡逑（圖邋３－５、圖邋３－６）。逡逑－２９－逡逑
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻】

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本文編號：2539323