【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可感染雞、鴨、火雞和其他禽類,使宿主出現(xiàn)氣囊炎、蜂窩組織炎、輸卵管炎、腹膜炎等癥狀,是養(yǎng)禽業(yè)最常見的致病菌之一。LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中,可產(chǎn)生種間通用信號分子AI-2,并調(diào)控細(xì)菌的多種生理功能。AI-2信號由胞外轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)需要借助于細(xì)胞的AI-2受體,目前哈維氏弧菌的LuxP型受體和鼠傷寒沙門的LsrB型受體已被證實存在多種細(xì)菌中。但關(guān)于APEC的AI-2受體,目前尚缺乏相關(guān)報道。本研究旨在通過建立APEC的AI-2受體檢測方法,運用蛋白組學(xué)技術(shù),篩選AI-2調(diào)控的靶蛋白,為進(jìn)一步探究LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)在APEC中的調(diào)控通路及鑒定AI-2受體提供參考,從而為從細(xì)菌群體角度防治APEC提供新的思路。1.AI-2受體蛋白檢測的方法建立為了建立AI-2受體檢測方法,本研究首先通過基因缺失的方法,構(gòu)建大腸桿菌BL21(DE3)的luxS基因缺失株,成功獲得不能產(chǎn)生AI-2的BL21(DE3)缺失株,并命名為BL21(DE3)?luxS。運用pColdTF質(zhì)粒構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌LsrB蛋白的原核表達(dá)載體pColdTF-lsrB,并分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)?luxS和BL21(DE3)中,經(jīng)體外誘導(dǎo)表達(dá),成功獲得具有生物學(xué)活性的Lsr B蛋白。運用純化的LsrB對AI-2分子進(jìn)行了結(jié)合與釋放實驗。實驗結(jié)果表明LsrB對AI-2分子具有結(jié)合能力,且結(jié)合能力是建立在LsrB的活性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上;活性結(jié)構(gòu)喪失后的LsrB不能夠結(jié)合AI-2,并釋放已結(jié)合AI-2。通過建立AI-2受體的檢測方法,為進(jìn)一步開展APEC的AI-2受體篩選奠定基礎(chǔ)。2.運用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選APEC中AI-2的靶蛋白對APEC內(nèi)化外源性AI-2的動力學(xué)研究表明,加入AI-2后第3 h時,APEC對AI-2內(nèi)化效率最高(72%)。但運用熒光定量PCR(qPCR)技術(shù),對APEC內(nèi)化外源性AI-2后luxS、pfs、iss和tsh的轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果表明,AI-2內(nèi)化5h時,上述基因轉(zhuǎn)錄水平變化最顯著(p0.001)。上述研究結(jié)果表明從APEC對AI-2的內(nèi)化和AI-2對APEC的基因調(diào)控是不同步的。為了研究AI-2對APEC的靶蛋白的調(diào)控作用,本研究結(jié)合APEC內(nèi)化外源性AI-2的內(nèi)化動力學(xué)結(jié)果,選擇AI-2加入APEC中5 h時的菌體,運用非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法檢測受AI-2調(diào)控靶蛋白,同時設(shè)立不加AI-2的APEC對照組,比較兩者蛋白表達(dá)差異,篩選APEC中受AI-2調(diào)控的靶蛋白。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示共檢測到受AI-2調(diào)控的顯著性差異蛋白質(zhì)479個,對差異蛋白的生物信息分析結(jié)果表明,受AI-2調(diào)控的靶蛋白主要參與APEC的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。3.AI-2靶基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析對運用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選到的AI-2靶蛋白進(jìn)行分析,選取5個受AI-2調(diào)控的靶蛋白基因(3630、tufB、phoH、kgtP和yjaE),運用Red同源重組的方法,成功獲得上述基因的缺失株。對構(gòu)建的缺失株進(jìn)行AI-2內(nèi)化檢測,結(jié)果表明,與野生株相比,上述基因的缺失,并不能顯著影響AI-2的內(nèi)化。本文推測選取的5個AI-2靶基因,不是APEC的AI-2受體基因,不參與APEC對AI-2的內(nèi)化。對缺失株的LD50檢測結(jié)果表明,缺失株對櫻桃谷鴨的致病能力未呈現(xiàn)明顯變化(出現(xiàn)10倍或以上的LD50變化可認(rèn)為毒力改變),表明本研究選取的5個AI-2靶基因,不參與對APEC的毒力調(diào)控。本研究結(jié)果表明,選定的該5個AI-2調(diào)控基因可能參與APEC中的某些受LuxS/AI-2型密度感應(yīng)調(diào)控的其他生理過程,具體的機(jī)制仍有待深入研究。本研究通過建立AI-2受體檢測方法、鑒定AI-2調(diào)控的靶蛋白和構(gòu)建靶基因的缺失株并開展相關(guān)的生物學(xué)研究,為進(jìn)一步開展APEC中AI-2受體及其調(diào)控作用提供參考。
【圖文】：

圖 1：細(xì)菌密度感應(yīng)（QS）信號的四個典型傳導(dǎo)路線[17]Fig 1: Canonical bacterial quorum-sensing (QS) circuitsA：革蘭氏陽性菌 QS 系統(tǒng)的 AIP 分子雙組分信號傳導(dǎo)；B：革蘭氏陽性菌 QS 系統(tǒng)的 AIP 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子傳導(dǎo)；C：在革蘭氏陰性菌 QS 系統(tǒng)的 LuxI/LuxR 型小分子傳導(dǎo)系統(tǒng)；D：在革蘭氏陰性菌 QS 系統(tǒng)的雙組分信號傳遞。革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物是一種小肽，被稱為自誘導(dǎo)肽（Autoinducingpeptides, AIPs）。革蘭氏陽性菌的 QS 系統(tǒng)通過對 AIPs 的產(chǎn)生、識別和生理反應(yīng)的控制，來實現(xiàn)其調(diào)控作用。在許多革蘭氏陽性菌中，寡肽信號分子 AIPs 是由膜上的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)識別（圖 1A）[19-21]。革蘭氏陽性菌的 QS 系統(tǒng)的 AIPs 通常是先形成前體（proAIPs），而編碼 proAIPs的基因大多分散在基因組中[19, 22-27]。AIPs 在胞內(nèi)產(chǎn)生，隨即被傳遞并外排出胞膜。當(dāng) AIP 的胞外濃度高時（發(fā)生于 HCD），它會與胞膜上一種雙組分組氨酸激酶受體結(jié)合。通常，AIP 結(jié)合后激活受體的激酶活性，使其磷酸化，并將磷酸基團(tuán)傳遞給胞質(zhì)內(nèi)的相應(yīng)調(diào)控分子。這種一系列的磷酸化反應(yīng)能夠調(diào)節(jié)與激活 QS 系統(tǒng)中的基因轉(zhuǎn)錄（圖 1A）。在某些革蘭氏陽性細(xì)菌的 QS 中，AIPs 會被輸送回進(jìn)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而與胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的變

圖 2：革蘭氏陰性菌不同菌種產(chǎn)生的 AHL 同系物Fig 2: Homoserine lactone autoinducers produced by different Gram-negative bacteria注：LuxI、LuxM、RhlI、LasL 均為 LuxR 的同源蛋白當(dāng)前已有一些 AHL 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)被研究的很深入，如綠膿桿菌的LasI/LasR-RhlI/RhlR 系統(tǒng)被證實控制毒力因子基因的表達(dá)和生物被膜的形成[54-57]，根瘤農(nóng)桿菌的 TraI/TraR 系統(tǒng)控制著向植物宿主傳送致癌 Ti 質(zhì)粒[44, 58, 59]，玉米細(xì)菌性枯萎病菌的 EsaI/EsaR 系統(tǒng)控制多糖的合成、粘附和對宿主細(xì)胞的定植[60, 61]。2.2 細(xì)菌種間的密度感應(yīng)系統(tǒng)—LuxS/AI-2 型密度感應(yīng)系統(tǒng)雖然 LuxI/LuxR 型系統(tǒng)已在大多數(shù)革蘭氏陰性被證實，但對某些弧菌（如哈維弧菌和霍亂弧菌）的研究發(fā)現(xiàn)它們的 QS 系統(tǒng)不符合 LuxI/LuxR 型系統(tǒng)的特性。這兩種弧菌（哈維弧菌和霍亂弧菌）既沒有 LuxI 同源基因，也不存在 LuxR 同源基因。然而，哈維弧菌和霍亂弧菌卻存在群體感應(yīng)系統(tǒng)所需的組件，，并且兩者高度類似[62-66]，這提示可能存在其他類型的 QS 系統(tǒng)。起初，人們在對哈維弧菌的生物發(fā)光研究中首次發(fā)現(xiàn)了 AI-2[67]。進(jìn)一步研究表明 AI-2 廣泛存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及在
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：2538939