【摘要】：鵝具有很強(qiáng)的就巢性和低產(chǎn)蛋性能,產(chǎn)蛋性能作為鵝養(yǎng)殖生產(chǎn)中一項(xiàng)重要的經(jīng)濟(jì)性狀,它與鵝產(chǎn)業(yè)發(fā)展、養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)。但產(chǎn)蛋性能是一個(gè)低遺傳力性狀,其表型值受非遺傳因素影響較大,運(yùn)用傳統(tǒng)表型選育的方法很難提高,嚴(yán)重阻礙了鵝產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)作為分子生物學(xué)水平上選擇目標(biāo)性狀的有效技術(shù)措施,具有適合低遺傳力性狀、不受環(huán)境影響和選擇結(jié)果可靠等特點(diǎn),但其前提是找到與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記或功能基因。為發(fā)掘鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)分子遺傳標(biāo)記,本研究首先運(yùn)用簡化基因組測序(RAD-sequencing)技術(shù)篩選產(chǎn)蛋性能高組與低組中等位基因頻率差異顯著的SNP,進(jìn)一步在大群體中驗(yàn)證分析候選SNP與鵝產(chǎn)蛋量的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上克隆SNP所在基因,對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。最終,將本研究鑒定的兩個(gè)分子標(biāo)記與鶴場選育工作結(jié)合,開展鵝產(chǎn)蛋性能分子標(biāo)記輔助選育的初步探索。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、運(yùn)用簡化基因組測序(RAD-sequencing)技術(shù)篩選產(chǎn)蛋性能相關(guān)SNP本實(shí)驗(yàn)共采集492只健康揚(yáng)州鵝血液樣品,為保證能篩選出大量準(zhǔn)確可靠的分子遺傳標(biāo)記,利用個(gè)體表型值選擇、個(gè)體估計(jì)育種值和家系內(nèi)選擇三種方法分別建立了3個(gè)高產(chǎn)蛋量DNA池(HIPV、HEBV、HF)和3個(gè)低產(chǎn)蛋量DNA池(LIPV、LEBV、LF)。RAD-sequencing結(jié)果顯示在HIPV和LIPV組,共產(chǎn)生4.0Gb數(shù)據(jù),4355萬條Clean Reads,分別獲得893,579和992,670個(gè)RAD-tag,最終共得到96,848個(gè)群體SNP標(biāo)記。對(duì)于HEBV和LEBV組,共產(chǎn)生3.8Gb數(shù)據(jù),4229萬條Clean Reads,分別獲得942,117和884,827個(gè)RAD-tag,最終共得到139,013個(gè)群體SNP標(biāo)記。對(duì)于HF和LF組,共產(chǎn)生4.4Gb數(shù)據(jù),4795萬條Clean Reads,分別獲得898,219和953,964個(gè)RAD-tag,共得到95,889個(gè)群體SNP標(biāo)記。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分別分析HIPV和LIPV、HEBV和LEBV、HF和LF三組SNP等位基因頻率分布差異。經(jīng)Bonferroni矯正后,在HIPV和LIPV組共得到25個(gè)差異顯著SNP(P5.2×10~(-6))。在HEBV和LEBV組共得到467個(gè)差異顯著SNP(P3.69×10~(-7)),在HF和LF組共得到817個(gè)差異顯著SNP(P5.2×10~(-6))。通過計(jì)算遺傳分化系數(shù)FST評(píng)價(jià)高低組間遺傳差異大小,比較三種方法組建產(chǎn)蛋性狀高低組的效果。結(jié)果顯示個(gè)體表型值選擇的FST為0.073,小于個(gè)體估計(jì)育種值選擇(0.093)和家系內(nèi)選擇(0.101),表明個(gè)體表型值選擇法高低組間遺傳差異較小,選擇準(zhǔn)確性較另外兩種方法低。因此,在候選產(chǎn)蛋相關(guān)SNP的挖掘中,本研究主要集中于個(gè)體估計(jì)育種選擇和家系內(nèi)選擇法。運(yùn)用AS-PCR分型技術(shù),在HEBV(n=10)和LEBV(n=10)組共獲得55個(gè)SNP的個(gè)體基因分型,其中10個(gè)SNP高低組間等位基因頻率差異顯著(P＜2.44×10~(-4)-4.63×10~(-10))。在HF(n=14)和LF(n=10)組共獲得37個(gè)SNP的個(gè)體基因分型,其中5個(gè)SNP高低組間等位基因頻率差異顯著(P＜1.80×10~(-4)-8.04×10~(-)8)。將高低組間驗(yàn)證差異顯著的候選SNP進(jìn)行群體驗(yàn)證,結(jié)果顯示其中8個(gè)SNP與鵝產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)。運(yùn)用線性回歸模型對(duì)8個(gè)顯著影響產(chǎn)蛋量的SNP進(jìn)行多標(biāo)記回歸分析,發(fā)現(xiàn)Record-111407、106975和112359三個(gè)SNP能共同影響鵝產(chǎn)蛋量�；�8個(gè)SNP所在RAD-tag序列,運(yùn)用反向PCR技術(shù),獲得8條延長的核苷酸序列。經(jīng)BLAST比對(duì)和同源基因檢索,獲得Record-106975、134172、112359、106582和111407五個(gè)SNP對(duì)應(yīng)的功能基因,分別為膜結(jié)合鳥苷酸激酶1(M4GI1)、KIAA1462、Rho GTP酶激活蛋白21(ARHGAP21)、乙酰輔酶A合成酶2(ACSF2)、星形肌動(dòng)蛋白2(ASTN2)。研究表明這8個(gè)SNP和5個(gè)基因?qū)轾Z產(chǎn)蛋性能改良提供新的研究思路。2、ACSF2基因克隆及基因表達(dá)分析鵝乙酰輔酶A合成酶2(ACSF2)基因編碼區(qū)序列全長1770bp,編碼589個(gè)氨基酸,其核苷酸序列與禽類其它物種ACSF2基因同源性較高,其中與鴨、雞的序列一致性為88.20%、76.55%。在鵝卵巢中發(fā)現(xiàn)4種剪接體,分別命名為ACSF2-1、ACSF2-2、ACSF2-3和ACSF2-4,其中ACSF2-1為優(yōu)勢剪接體(1770bp)。ACSF2-2、ACSF2-3和ACSF2-4編碼區(qū)序列全長分別為1692bp、1599bp、1917bp,分別編碼563、532、638個(gè)氨基酸。與優(yōu)勢剪接體(ACSF2-1)相比,ACSF2-2在第14外顯子缺失46bp,發(fā)生可變的5'端剪接。ACSF2-3完整缺失外顯子7、外顯子8和外顯子9,同時(shí)在外顯子13和14之間插入127bp(E14a)。ACSF2-4在外顯子13和14之間插入E14a。ACSF2基因4種剪接體蛋白的亞細(xì)胞定位顯示,4種剪接體蛋白均定位于線粒體。ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4在腎臟、卵巢、小腸、肝臟、腹脂、肌胃、胸肌、心臟、下丘腦、垂體10個(gè)組織以及卵泡顆粒細(xì)胞中均表達(dá),而ACSF2-2基因下丘腦、垂體和卵泡顆粒細(xì)胞不表達(dá)。ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4在不同發(fā)育階段卵泡(F1～F5、SMF、1wf、swf)顆粒細(xì)胞中均表達(dá),其中ACSF2-1表達(dá)量高于ACSF2-3和ACSF2-4。采用Real-time PCR對(duì)鵝高低產(chǎn)蛋組(HEP、LEP)卵巢組織中ACSF2基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示HEP卵巢組織中ACST2基因mRNA表達(dá)水平極顯著低于LEP(P0.01),同樣HEP卵巢組織中ACSF2-2,ACSF2-3和ACSF2-4 mRNA表達(dá)水平顯著低于LEP(P0.05)。卵泡顆粒細(xì)胞中ACSF2基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4后,顆粒細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均極顯著高于對(duì)照組(P0.01)。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA771和siRNA1381能顯著抑制ACSF2基因在卵泡顆粒細(xì)胞中mRNA表達(dá),ACSF2基因敲減導(dǎo)致卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。本研究表明ACSF2基因表達(dá)與鶴產(chǎn)蛋性能相關(guān),其表達(dá)水平影響卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)水平,揭示ACSF2可能在卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。3、MAGI1基因克隆及基因表達(dá)分析鵝膜結(jié)合鳥苷酸激酶1(MAGI1)基因編碼區(qū)全長4152bp,編碼1383個(gè)氨基酸。MAGI1核苷酸序列與禽類其它物種ACSF2基因同源性較高,鶴與雞之間一致性為90.98%。在鵝卵巢中發(fā)現(xiàn)5種剪接體,分別命名為MAGI1-1、MAGI1-2、MAGI1-3、MAGI1-4和M4GI1-5,其中MAGI1-1即為優(yōu)勢剪接體(4152bp)。MAGI1-2、MAGI1-3、MAGI1-4和MAGI1-5編碼區(qū)序列全長分別為4116bp、3945bp、4149bp和2805bp,分別編碼1371、1314、1382和934個(gè)氨基酸。MAGI1基因在鵝卵巢、卵泡顆粒細(xì)胞、腹脂以及肌胃中表達(dá)量較高、其次為腎臟,下丘腦和垂體中表達(dá)量最低。在不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中,MAGI1基因在等級(jí)卵泡F2中表達(dá)量顯著升高,在F1、F3、F4、F5卵泡表達(dá)量較低。MAGI1基因在等級(jí)前卵泡syf、lwf、swf中表達(dá)水平一致,且低于F2卵泡。采用Real-time PCR對(duì)鶴HEP和LEP卵巢組織中MAGI1基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示HEP卵巢組織中MAGI1基因mRNA表達(dá)水平顯著低于LEP(P=0.05)。卵泡顆粒細(xì)胞中MAGI1基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染MAGI1-1、MAGI1-2、MAGI1-3和MAGI1-4后,顆粒細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均極顯著高于對(duì)照組(P0.01)。在siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中,siRNA507和siRNA847能顯著抑制MAGI1基因在卵泡顆粒細(xì)胞中mRNA表達(dá),其中siRNA847基因敲減效果最佳。siRNA847處理后,導(dǎo)致卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高。本研究表明MAGI1基因表達(dá)與鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān),其表達(dá)水平能調(diào)節(jié)卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase-3表達(dá),表明MAGI1可能通過自身在細(xì)胞連接中的作用,維持卵泡顆粒細(xì)胞的正常生長,從而調(diào)控卵泡的生長發(fā)育。4、PAPPA基因克隆及基因表達(dá)分析鵝妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPPA)基因編碼區(qū)全長4884bp,包括24個(gè)外顯子,編碼1627個(gè)氨基酸。PAPPA核苷酸序列與禽類其它物種同源性極高,鵝與鴨序列一致性為98%。亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)PAPPA蛋白為分泌性蛋白,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外。鵝PAPPA基因在除肝臟以外的其它組織組織中均表達(dá),在卵巢中的表達(dá)量最高,其次為心臟、胸肌。在不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中,PAPPA基因在syf、lwf和swf的表達(dá)量較高,而在等級(jí)卵泡(F1-F5)其mRNA表達(dá)水平逐漸降低。PAPPA基因在不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)模式,進(jìn)一步說明PAPPA基因在卵泡的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。采用Real-time PCR對(duì)鵝HEP和LEP卵巢組織中PAPPA基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示PAPPA基因在HEP卵巢中mRNA表達(dá)水平高于LEP,但差異不顯著(P0.05)。PAPPA基因在卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)顯著降低Caspase-3基因的表達(dá)(P0.01),且隨著PAPPA基因過表達(dá)量的升高而降低。本研究表明隨著卵泡的生長,PAPPA基因在顆粒細(xì)胞的表達(dá)不斷降低,同時(shí)PAPPA基因上調(diào)能顯著降低顆粒細(xì)胞中Caspase-3的基因表達(dá),雖然在高低組卵巢中PAPPA基因mRNA表達(dá)無顯著差異,但分析認(rèn)為PAPPA基因與卵泡顆粒細(xì)胞的生長相關(guān),且參與卵泡的生長發(fā)育調(diào)控。5、鵝分子標(biāo)記輔助選擇育種本實(shí)驗(yàn)采集第七世代(2014年)400只成年健康揚(yáng)州母鶴和第九世代(2015年)596只幼鵝(公鵝221只,母鵝375只)血液樣品,并完成Record-106582、106975和1111407三個(gè)SNP在第七代鵝群的基因分型,結(jié)果表明Record-106582 AA和CA基因型產(chǎn)蛋量顯著高于CC基因型(P0.05),AA與CA基因型差異不顯著(P0.05)。Record-106975三種基因型間產(chǎn)蛋量差異不顯著,但GG基因型產(chǎn)蛋量高于AA基因型4.4個(gè)(P0.09),高于全群平均產(chǎn)蛋量(69.72±20.98)7.2個(gè)。Record-111407三種基因型間產(chǎn)蛋量差異不顯著(P＞0.05)。最終確定Record-106582和106975作為產(chǎn)蛋性能分子標(biāo)記。根據(jù)女兒生產(chǎn)記錄計(jì)算第七世代公鵝估計(jì)產(chǎn)蛋量,同時(shí)結(jié)合第七世代母鵝產(chǎn)蛋量估計(jì)第八世代公鵝的個(gè)體產(chǎn)蛋性能;第八世代母鵝產(chǎn)蛋性能以前20周產(chǎn)蛋量表示。根據(jù)第八世代鵝場實(shí)際選配方案,選擇39只高產(chǎn)公鵝與78只高產(chǎn)母鵝的后代作為留種群(第九世代),共596只,其中公鶴221只,母鵝375只。根據(jù)Record-106582、106975在留種群基因型分析結(jié)果,最終組建兩個(gè)高產(chǎn)純合基因型核心群,分別為141只(公鵝39只,母鵝102只)和280只(公鵝76只,母鵝204只)。
【圖文】：

麗和睪麗含量要顯著高于正常生長巧泡［ｕ］。家禽卵泡的閉鎖同樣具有等級(jí)性特征，閑逡逑鎖主要發(fā)生在等級(jí)前卵泡，而等級(jí)卵泡極少發(fā)生閉鎖。在家禽正常生殖周期中，卵泡逡逑閉鎖多發(fā)生于直徑２－８ｍｍ的卵泡（圖１－３）。逡逑４逡逑

婭屖弱？二！ｉｒ■sD壚^沐義锨汕汕懾五義賢跡保布儀莩墑炻雅萁峁故疽饌跡郟保蒎義希疲椋玨澹保玻澹櫻悖瑁澹恚幔簦椋沐澹洌椋幔紓潁幔礤澹錚駑澹恚幔簦酰潁邋澹媯錚歟歟椋悖歟邋澹椋鑠澹校鍔劍簦潁澹錚觶幔潁椋幔鑠義希保臣儀萋雅蕕謀賬義下雅荼賬鍬雅莘⒂桃恢終５納硐窒�，主要外观表象为卵泡变形或塌鲜n㈠義下鴉莆鎦實(shí)娜嬉夯準(zhǔn)奧雅荼礱嬗醒摺Ｂ雅荼賬諑雅莘⒂娜魏問逼詼薊岱⑸�，辶x系雅蕕謀賬饕蟹⑸冢玻福恚淼穆雅蕁Ｔ詡儀菅成�，产祳W實(shí)母叩橢麇義弦【鲇諑雅荼賬氖�。旷７w簦岬茸芙嶁緣慕椅衙荼賬治街中停捶潛彥義閑禿捅研吐雅荼賬�。窛摤裂型辟~饕⑸謚本緞∮冢擔(dān)埃埃酰淼穆雅藎硐治雅蒎義夏諶菸鏤眨は赴涂帕Ｏ赴擲�。爆裂型辟~饕⑸謚本洞笥冢擔(dān)埃埃酰淼穆雅藎義現(xiàn)饕氐鬮雅荼諂屏選⑾赴庖紓郟保保蕁＃耍錚觶幔螅愕齲ǎ保梗梗玻┒員確治雋撕咨ず捅賬義下雅萸穡芯勘礱鲝I閉鎖卵泡中膽固醇和類固醇酶的含量較高
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S835

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2538455