【摘要】：卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及類(lèi)固醇生成在卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。褪黑素調(diào)控卵泡內(nèi)膜中凋亡和類(lèi)固醇生成的具體機(jī)制目前還不清楚,該研究對(duì)于進(jìn)一步闡明褪黑素在卵泡發(fā)育和閉鎖中的調(diào)控作用,促進(jìn)卵泡體外培養(yǎng)和應(yīng)用具有重要意義。本研究選擇牛3-4 mm卵泡在體外研究褪黑素對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞類(lèi)固醇生成及卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)一步闡明具體的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果如下:1.褪黑素對(duì)牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與類(lèi)固醇生成的影響用0 ng/mL,1 ng/m L,10 ng/m L,100 ng/mL的褪黑素處理卵泡,撕取卵泡內(nèi)膜,RT-qPCR檢測(cè)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞褪黑素受體MT1、MT2的表達(dá),結(jié)果顯示10 ng/m L的褪黑素對(duì)褪黑素受體MT1、MT2的促進(jìn)效果最明顯。卵泡培養(yǎng)液中添加10 ng/mL的褪黑素處理,RT-qPCR檢測(cè)撕取的卵泡內(nèi)膜LHR,類(lèi)固醇生成相關(guān)基因及凋亡基因BCL2、BAX、CASPASE的表達(dá),Elisa檢測(cè)卵泡培養(yǎng)上清中雄烯二酮和孕酮的分泌。結(jié)果顯示褪黑素顯著促進(jìn)LHR和STAR的表達(dá),顯著促進(jìn)孕酮的分泌,顯著促進(jìn)抗凋亡基因BCL2的表達(dá),BCL2和BAX比率增加。用10 ng/mL褪黑素處理體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞,使用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,染色結(jié)果顯示褪黑素處理組的凋亡率低于對(duì)照組。本研究表明褪黑素影響卵泡中卵泡內(nèi)膜細(xì)胞類(lèi)固醇的生成,抑制卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡。2.MT1和MT2介導(dǎo)褪黑素對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與類(lèi)固醇生成的作用在含有10 ng/m L褪黑素的卵泡培養(yǎng)液中添加10μM褪黑素受體非特異性的抑制劑Luzindole或10μM MT2特異性抑制劑4P-PDOT處理,RT-qPCR檢測(cè)撕取的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞褪黑素受體MT1、MT2和LHR、STAR,抗凋亡基因BCL2的表達(dá),Elisa檢測(cè)卵泡培養(yǎng)上清中孕酮的分泌。結(jié)果顯示,添加Luzindole后顯著抑制褪黑素誘導(dǎo)的MT1和MT2的表達(dá),添加4P-PDOT后顯著抑制MT2的表達(dá);添加Luzindole或4P-PDOT處理均顯著抑制褪黑素誘導(dǎo)的LHR、STAR、BCl2的表達(dá);添加Luzindole處理顯著抑制孕酮的分泌。本研究表明MT1和MT2介導(dǎo)褪黑素對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和類(lèi)固醇生成的調(diào)控作用。3.PI3K/AKT通路介導(dǎo)褪黑素對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與類(lèi)固醇生成的作用在含有10 ng/mL褪黑素的卵泡培養(yǎng)液中添加25μM通路抑制劑LY294002處理,RT-qPCR檢測(cè)撕取的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞LHR、STAR及抗凋亡基因BCL2的表達(dá),Elisa檢測(cè)卵泡培養(yǎng)上清中孕酮的分泌。結(jié)果顯示添加LY294002處理顯著抑制褪黑素誘導(dǎo)的LHR、STAR和BCL2的表達(dá),添加LY294002處理顯著抑制孕酮的分泌。研究表明PI3K/AKT通路在褪黑素介導(dǎo)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與類(lèi)固醇生成中起到一定的調(diào)控作用。結(jié)論:MT1/MT2和PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)褪黑素調(diào)控牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與類(lèi)固醇生成。
【圖文】：

第二章 褪黑素的研究進(jìn)展 成中的作用仍所知甚少。本研究的目的意義本研究在體外條件下利用褪黑素處理牛 3-4 mm 的卵泡，研究褪黑素對(duì)卵固醇生成及卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步闡明具體的調(diào)控機(jī)制。該步闡明褪黑素在卵泡發(fā)育和閉鎖中的調(diào)控作用，促進(jìn)卵泡體外培養(yǎng)和應(yīng)用。

圖 3-1 牛小腔卵泡的分離細(xì)胞完整，卵泡內(nèi)膜血管不豐富；B: 卵泡壁顆粒細(xì)胞不完整，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞完整，卵泡內(nèi)膜血管豐富；D: 卵泡壁顆粒細(xì)胞不完整，卵泡內(nèi)膜Fig.3-1 The separation of bovine small antral follicleith complete granulosa cells and poor blood vessels; B: Follicles with incom blood vessels; C: Follicles with complete granulosa cells and rich blood vessete granulosa cells and rich blood vessels膜 胞純度鑒定圖 3-1C 所示，健康的沒(méi)有明顯凋亡現(xiàn)象的卵泡，分離卵泡內(nèi)胞，使用 RT-PCR 的方法鑒定卵泡內(nèi)膜細(xì)胞細(xì)胞特異基因及顆（圖 3-2），，鑒定結(jié)果顯示分離的卵泡內(nèi)膜表達(dá)膜細(xì)胞特異基因細(xì)胞特異基因 FSHR。膠原酶法分離卵泡內(nèi)膜細(xì)胞，體外培養(yǎng)所使用的一抗是 CYP17a1 和 FSHR。鑒定結(jié)果顯示膜細(xì)胞白，而不表達(dá) FSHR 蛋白(圖 3-3)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示膜細(xì)胞的陽(yáng)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S823

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1 王曉梅;褪黑素對(duì)牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和類(lèi)固醇生成的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2535929