【摘要】：含patatin樣磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3,PNPLA3)基因?qū)儆趐atatin樣磷脂酶家族,該家族都包含patatin結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域主要參與甘油三酯代謝和膜流動(dòng),并具有脂肪�；饷富钚�。而PNPLA3具有磷脂酶和�；D(zhuǎn)移酶雙重功能,并參與了脂質(zhì)代謝,其在調(diào)節(jié)甘油三酯代謝方面有著不可替代的作用。因?yàn)樵谥竞湍芰看x方面的調(diào)控功能,PNPLA3基因被作為研究動(dòng)物的肉類品質(zhì),脂肪積累及生長(zhǎng)發(fā)育侯選基因,同時(shí)其又與肥胖和糖尿病緊密相關(guān),成為治療肥胖和非酒精性脂肪肝的潛在藥物靶點(diǎn)。但是PNPLA3基因與中國(guó)黃牛生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)性,以及在黃牛肝臟脂肪中的作用機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)一步研究。因此,本研究以中國(guó)黃牛PNPLA3基因?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)該基因的遺傳變異進(jìn)行研究,以期找到對(duì)中國(guó)黃牛生長(zhǎng)有顯著影響的分子標(biāo)記,同時(shí)對(duì)PNPLA3基因在秦川牛不同年齡各個(gè)組織的表達(dá)量進(jìn)行分析研究,另外構(gòu)建了秦川牛PNPLA3基因啟動(dòng)子不同截短體熒光素酶表達(dá)載體,并根據(jù)熒光素酶報(bào)告基因的活性找出啟動(dòng)子核心區(qū)域,為深入研究PNPLA3基因啟動(dòng)子對(duì)動(dòng)物機(jī)體的能量代謝等方面的功能研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。1.黃牛PNPLA3基因遺傳變異研究本研究運(yùn)用混合DNA池測(cè)序與Forced RFLP-PCR(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)對(duì)秦川牛,南陽(yáng)牛和郟縣紅牛三個(gè)中國(guó)地方黃牛品種(共660頭)的PNPLA3基因進(jìn)行了多態(tài)的掃描和分型,并與秦川牛的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果在這三個(gè)黃牛品種中共檢測(cè)到4個(gè)錯(cuò)義突變,分別為g.A2980G(SNP1),g.A2996T(SNP2),g.A36718G(SNP3)和g.G36850A(SNP4)。群體遺傳參數(shù)分析表明,SNP1、SNP3和SNP4屬于中度多態(tài)(0.25PIC0.50),且4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基本都符合哈迪溫伯格平衡。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),SNP 3和SNP 4位點(diǎn)間處于高度連鎖狀態(tài)(D'0.7,r20.3);單倍型分析表明,共有4個(gè)單倍型,且單倍型2(-AAGA-)在所有黃牛品種中出現(xiàn)的頻率最高。同時(shí),關(guān)聯(lián)分析表明,這4個(gè)SNPs與秦川牛的體重和胸圍等生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)(P0.05)。具體說(shuō)來(lái),秦川牛SNP1位點(diǎn)的A1G1基因型,SNP2位點(diǎn)的A2A2基因型和SNP3位點(diǎn)的A3A3基因型個(gè)體的體重均顯著高于其他個(gè)體(P0.05),SNP1位點(diǎn)的A1G1基因型和SNP4位點(diǎn)的G4G4基因型個(gè)體的胸圍也都顯著優(yōu)于其他個(gè)體(P0.05)。所以,這4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)可作為肉牛性狀改良的分子標(biāo)記,用于標(biāo)記輔助選擇。2.秦川牛PNPLA3基因組織表達(dá)規(guī)律研究利用qRT-PCR技術(shù),對(duì)秦川牛PNPLA3基因進(jìn)行表達(dá)規(guī)律研究,為進(jìn)一步揭示牛PNPLA3基因在脂肪形成中的作用提供一些基礎(chǔ)資料。秦川牛PNPLA3基因在3個(gè)發(fā)育階段(胎牛、犢牛、成年牛)7個(gè)組織中的相對(duì)定量結(jié)果顯示,其表達(dá)受時(shí)空特異性的影響。PNPLA3基因在同一時(shí)期各組織間差異表達(dá),在三個(gè)時(shí)期的肝臟中其表達(dá)量均很高,在犢牛和成年牛的脂肪組織中表達(dá)豐度最高(胎牛難以采集脂肪樣品),在胎牛和犢牛的脾臟中表達(dá)量也較高,而其他組織中表達(dá)量都不是很高。同時(shí),比較秦川牛不同發(fā)育階段同一組織的PNPLA3基因表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)量受發(fā)育時(shí)期影響顯著,心臟、肺臟、腎臟和肌肉中的變化尤為明顯,表達(dá)量隨年齡增加呈降低趨勢(shì)(P0.05)。另外,將PNPLA3 mRNA表達(dá)與SNP結(jié)合分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP1位點(diǎn)AG表達(dá)量顯著高于AA與GG(P0.05),這與體尺性狀分析相吻合,推測(cè)該位點(diǎn)正向調(diào)控生長(zhǎng)性狀,而SNP4位點(diǎn)各個(gè)基因型表達(dá)量與體尺性狀相反,猜測(cè)該位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀負(fù)相關(guān)。3.秦川牛PNPLA3啟動(dòng)子活性區(qū)域的篩選采用基因克隆、DNA測(cè)序和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)等技術(shù)手段,構(gòu)建秦川牛PNPLA3基因5′側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)片段及固定3′端的不同截短體的pGL-3重組質(zhì)粒,分別與內(nèi)參對(duì)照載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)熒光素酶活性測(cè)定,確定啟動(dòng)子活性區(qū)域。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了啟動(dòng)子不同截短體的熒光素酶表達(dá)載體pGL3-Basic-P1、pGL3-Basic-P2、pGL3-Basic-P3、pGL3-Basic-P4、p GL3-Basic-P5,熒光素酶活性分析表明,啟動(dòng)子中段區(qū)域(P2,-1696~-1192 bp)可能存在負(fù)調(diào)控元件。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2524722