【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是嚴重影響全球生豬產(chǎn)業(yè)的病原,引致以妊娠母豬繁殖障礙和生長豬呼吸道疾病為特征的豬繁殖與呼吸綜合征。PRRSV具有毒株多樣性和復雜的致病機制,其感染的靶細胞主要是豬肺泡巨噬細胞(Porcinealveolarmacrophages,PAMs),可引起豬的天然免疫免疫抑制。本研究聚焦于PRRSV感染對PAMs IFN-β表達的影響及其分子機制,分析了基因2型PRRSV不同致病性毒株對IFN-β表達的影響,進一步研究了細胞microRNA對IFN-β3蛋白表達的調(diào)節(jié)作用以及影響PRRSV不同毒株對IFN-β表達抑制效應的病毒蛋白,以期為闡明PRRSV抑制靶細胞天然免疫的機制提供科學依據(jù)。利用Real-time PCR技術,對PRRSV不同致病性毒株感染原代PAMs的天然免疫功能相關分子與病毒受體的mRNA轉錄及其差異性進行了分析。結果表明,PRRSV早期感染可誘導Ⅰ型干擾素、干擾素刺激基因、多數(shù)細胞因子和趨化因子以及PoSn的mRNA轉錄水平上調(diào);高致病性毒株JXwn06誘導Ⅰ型干擾素、干擾素刺激基因、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、CXCL10、PoSn的mRNA轉錄上調(diào)水平高于低致病性毒株HB-1/3.9,而誘導IL-1α、IL-1β、IL-23p19、CCL3、CCL20、CXCL2、CXCL8、MIF 的 mRNA 轉錄上調(diào)水平低于 HB-1/3.9。利用 Real-time PCR 和定量 ELISA技術,對感染PRRSV不同致病性毒株的PAMs中Ⅰ型干擾素的mRNA轉錄與蛋白表達水平及其差異進一步分析。結果表明,PRRSV早期感染PAMs的IFN-α和IFN-β mRNA的轉錄水平上調(diào),但IFN-α、 IFN-β蛋白表達受到抑制,且呈病毒感染劑量依賴性;JXwn06誘導Ⅰ型干擾素mRNA轉錄上調(diào)的水平高于HB-1/3.9,而對Ⅰ型干擾素蛋白表達的抑制作用卻強于HB-1/3.9。由此提示,PRRSV感染抑制PAMs的Ⅰ型干擾素蛋白表達是通過轉錄后抑制機制,且高致病性毒株的轉錄后抑制效應更強。分析了豬miRNA (let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145)對豬IFN-β蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。雙熒光素酶活性檢測結果表明,豬let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能夠靶向結合豬IFN-β基因的 3'UTR,結合區(qū)域分別為 3'UTR 的 160-181 bp、9-31 bp、27-47 bp、12-32 bp 序列。 miRNA模擬物和抑制劑轉染試驗結果表明,let-7b、miR-26a、miR-34a和rmiR-145模擬物均能夠抑制PAMs分泌IFN-β蛋白,且呈劑量依賴性;let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145抑制劑均能夠減弱內(nèi)源性miRNA對PAMs分泌IFN-β蛋白的抑制作用,且呈劑量依賴性。Poly Ⅰ:C刺激試驗結果表明,豬IFN-β蛋白對let-7b、miR-26a、rmiR-34a和miR-145的表達具有負反饋調(diào)節(jié)作用。由此表明,豬let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能夠通過靶向結合IFN-β基因的3'UTR而抑制IFN-β蛋白表達。利用Real-timePCR技術,分析了 PRRSV不同致病性毒株早期感染PAMs的miRNA表達水平。結果表明,PRRSV早期感染PAMs的let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145表達上調(diào),且JXwn06感染的上調(diào)水平高于HB-1/3.9。miRNA抑制劑轉染試驗結果表明,let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145抑制劑能夠減弱PRRSV對IFN-β蛋白表達的抑制作用,并上調(diào)IFN-βp蛋白表達。miRNA sensor雙熒光素酶活性檢測結果表明,NSP1α、NSP1β和NSP2是引起let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145表達上調(diào)的主要病毒蛋白,且NSP1β和NSP2是PRRSV不同致病性毒株上調(diào)miRNAs水平出現(xiàn)差異的主要病毒蛋白。利用慢病毒包裝技術,成功構建并包裝了慢病毒LvJn1β、LvJn2、LvHn1β、LvHn2。慢病毒抑制IFN-βp蛋白表達的作用分析結果表明,LvJn1β、LvJn2、LvHn1β、LvHn2均能夠顯著抑制IFN-β蛋白表達,且LvJn1β、LvJn2對IFN-β蛋白表達的抑制作用分別比LvHn1β、LvHn2更強。由此表明,NSP1β和NSP2是PRRSV不同致病性毒株抑制IFN-β蛋白表達水平出現(xiàn)差異的主要病毒蛋白。比較分析了 28株基因2型PRRSV高致病性毒株和10株低致病性毒株的NSP1β和NSP2氨基酸序列,結果表明,NSP1β和NSP2的2個和14個保守突變氨基酸位點是高、低致病性毒株之間保守的差異氨基酸位點。進一步以JXwn06和HB-1/3.9的全長cDNA克隆為骨架,利用感染性克隆平臺和點突變技術,成功構建和拯救了 NSP1β、NSP2單獨置換與同時置換各自保守突變氨基酸位點的突變病毒 RvJMn1β97L104N、RvJMn2、RvJMn1β97L104N+n2、RvHMn1β97S104Y、RvHMn2、RvHMn1β97S104Y+n2。 miRNA sensor雙熒光素酶活性分析結果表明,NSP1β的保守突變氨基酸位點與PRRSV不同致病性毒株NSP1β上調(diào)miR-26a、miR-34a、miR-145的差異有關,而NSP2的保守突變氨基酸位點與PRRSV不同致病性毒株NSP2上調(diào)let-7b的差異有關。對突變病毒抑制IFN-β蛋白表達的作用分析結果表明,RvHMn1β97S104Y+n2對IFN-β蛋白表達的抑制作用顯著高于 RvJMn1β97L104N+n2,而 RvJMn1β97L104N、RvHMn1β97S104Y 以及 RvJMn2、RvHMn2之間差異不顯著。由此表明,NSP1β+NSP2保守突變氨基酸位點與PRRSV不同致病性毒株抑制豬IFN-β蛋白表達的差異有關。綜上所述,我們的研究表明:(1) PRRSV感染抑制PAMs的Ⅰ型干擾素蛋白表達是通過轉錄后抑制機制,高致病性毒株抑制效應強于低致病性毒株;(2)豬miRNAs (let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145)可通過靶向結合IFN-β基因的3'UTR而抑制IFN-β蛋白表達;(3) PRRSV可通過上調(diào)let-7b、miR-26a、miR-34a、miR-145而抑制IFN-β蛋白表達,且高致病性毒株上調(diào)miRNAs 水平更高;(4) NSP1α、NSP1β 和 NSP2 是 PRRSV 上調(diào) let-7b、miR-26a、miR-34a、miR-145的主要病毒蛋白,且NSP1β和NSP2是引起PRRSV不同致病性毒株上調(diào)miRNAs水平與抑制IFN-β蛋白表達水平出現(xiàn)差異的主要病毒蛋白;(5) NSP1β+NSP2保守突變氨基酸位點與PRRSV不同致病性毒株抑制IFN-β蛋白表達的差異有關。研究結果揭示了 PRRSV感染抑制PAMs IFN-β蛋白表達的分子機制,為闡明PRRSV抑制靶細胞天然免疫的分子機制提供了科學依據(jù)。
【圖文】：

集細胞樣品，提取細胞總ＲＮＡ并反轉錄后，通過Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ對豬ＩＦＮ－ｃｕ邋ＩＦＮ－ｐ的ｍＲＮＡ轉逡逑錄水平進行檢測，將目的基因的測定結果通過與管家基因ＲＰＬ４進行校正后采用法進行相逡逑對定量，，結果如圖２－１所示。與未感染組對照相比，在１２邋ｈｐｉ和２４邋ｈｐｉ，邋ＪＸｗｎ０６感染組和ＨＢ－１／３．９逡逑感染組的豬ＩＦＮ－ａｍＲＮＡ、ＩＦＮ－ｐ邋ｍＲＮＡ轉錄水平均上調(diào)，由此說明，ＰＲＲＳＶ早期感染原代ＰＡＭｓ逡逑可誘導豬ＩＦＮ－ｃｕ邋ＩＦＮ－ｐ的ｍＲＮＡ轉錄。逡逑比較ＪＸｗｎ０６感染組和ＨＢ－１／３．９感染組，結果表明，ＪＸｗｎ０６感染組上調(diào)豬ＩＦＮ－ｃｕ邋ＩＦＮ－ｐ的逡逑ｍＲＮＡ轉錄水平更高；而且豬ＩＦＮ－ａ邋ｍＲＮＡ轉錄水平在感染后２４邋ｈ出現(xiàn)極顯著差異（ｐ邋＜邋０．００１），逡逑豬ＩＦＮ－ｐ邋ｍＲＮＡ轉錄水平在感染后１２邋ｈ出現(xiàn)顯著差異（ｐ＜邋０．０５），在感染后２４邋ｈ出現(xiàn)極顯著差逡逑異（；？＜０．００１）（圖邋２－１）。逡逑以上結果表明

圖２－２邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測感染ＰＲＲＳＶ的
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 蒲靜;PRRSV對豬肺泡巨噬細胞天然免疫功能影響的分子機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2005年

本文編號：2520400