【摘要】：引起豬腹瀉的病毒性病原主要有豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)和輪狀病毒(Porcine rotavirus,PRV)),其中PEDV與TGEV同屬于冠狀病毒科,是最重要的兩種病原,引起發(fā)病豬嚴重腹瀉、嘔吐和脫水,各年齡的豬均都可感染,死亡率可高達100%。我國大部分省市地區(qū)都有這兩種病發(fā)生的報道,臨床上常呈混合感染,或繼發(fā)感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。目前實驗室診斷方法以病毒分離鑒定、PCR擴增技術(shù)為主。病毒分離周期長,且難度大;而PCR檢測存在一定比例的假陽性。本研究利用生物素-親和素具有高親和性的特性,將PEDV和TGEV Ig G抗體分別進行生物素標記,并以商品化PEDV S蛋白單克隆抗體和TGEV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,分別建立了檢測PEDV、TGEV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗體夾心ELISA檢測方法,并初步建立單一病原檢測的Luminex體系,為后續(xù)豬腹瀉病原的多重檢測方法研究奠定基礎(chǔ)。1.PEDV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立以體外表達的PEDV S蛋白作為抗原,商品化抗PEDV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,生物素標記的抗PEDV Ig G作為檢測抗體,建立了PEDV生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明,該方法可以檢測到PEDV S蛋白的最低檢測限量為20 ng/ul,且穩(wěn)定性和特異性較好。利用該方法對采集的25份臨床豬腹瀉樣品進行檢測,結(jié)果檢出3份PEDV陽性樣品,與RT-PCR檢測方法的符合率為100%。2.TGEV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立以商品化的TGEV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,純化的TGEV細胞毒作為抗原,生物素標記的抗TGEV Ig G作為檢測抗體,建立了檢測TGEV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明,該方法可檢測TGEV細胞毒的最低濃度為17.5 ng/μl,敏感性較好。此外,利用該方法對采集的25份臨床豬腹瀉樣品進行檢測,結(jié)果檢出1份TGEV陽性樣品,與RT-PCR檢測方法的符合率為100%。3.PEDV、TGEV Luminex方法初步建立應用xMAP液相芯片技術(shù)原理,以建立的雙抗夾心反應條件為參照,用偶聯(lián)微球的商品化單克隆抗體和生物素化Ig G抗體,初步建立了捕獲PEDV、TGEV病原的Liqui Chip液相蛋白芯片檢測方法。本研究成功建立了PEDV和TGEV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA檢測方法,且可用于臨床樣品的篩檢。同時對Luminex檢測方法進行初步研究,為建立豬腹瀉多病原檢測系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

目前該技術(shù)常用于核酸、蛋白等大分子的檢測，以及酶學，受體和配體，，號通路等方面的研究。Pickering[56]等建立了檢測肺炎球菌多糖疫苗抗體的液相測技術(shù)，Steven Lawson等[57]應用該技術(shù)建立了可同時檢測8種豬細胞因子的液相蛋白測方法。該方法的原理圖如下[58]：

SDS-PAGE檢測抗PEDVIgG純化效果
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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本文編號：2519263