【摘要】：為了研究類固醇激素是否通過體細胞參于哺乳動物胚胎的發(fā)育調(diào)控。本文探討了P_4(Progesterone,P_4)和雌二醇(Estradiol,E_2)對牦牛輸卵管上皮細胞分泌輸卵管糖蛋白(oviductin,Ovn)及骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)的影響。選用牦牛輸卵管上皮細胞,采用組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶消化法獲得牦牛輸卵管上皮細胞,運用RT-PCR克隆和核酸測序獲得牦牛骨橋蛋白cDNA;選取第4代牦牛輸卵管上皮細胞,分別加入不同濃度的P_4和E_2,運用實時熒光定量(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和免疫熒光(Immunofluorescence technique,IF)分別分析P_4和E_2對體外培養(yǎng)牦牛輸卵管上皮細胞Ovn和OPN表達的影響;用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)測定不同濃度P_4和E_2作用后上清培養(yǎng)液中OPN的濃度。研究結(jié)果表明:(1)當P_4濃度為5~25 ng/mL時,隨著P_4濃度的增加Ovn的表達量也逐漸增高;當P_4為25 ng/mL時,Ovn基因和蛋白表達量為最高;P_4濃度為50~200ng/mL時,Ovn基因和蛋白的表達量隨著濃度的增加反而逐漸減少。(2)E_2可以提高牦牛輸卵管上皮細胞的Ovn mRNA和蛋白相對表達量;當E_2濃度為25 ng/mL時,輸卵管上皮細胞的Ovn mRNA和蛋白相對表達量最高,顯著高于E_2濃度為10、50、100和200 ng/mL組;對照組Ovn mRNA和蛋白表達量最低。(3)牦牛的OPN與黃牛的同源性最高,達到99.2%;牦牛與山羊(Capra hircas)、綿羊(Ovis aries)、野豬(Sus scrofa)的相似性分別為93.8%、93.4%、73.6%;牦牛的OPN基因為1135 bp,包含完整開放閱讀框837 bp,共編碼278個氨基酸(GenBank登錄號:KY402045)。(4)體外培養(yǎng)體系中添加不同濃度的P_4,OPN的mRNA和蛋白表達量均有所增加,且當P_4濃度為25 ng/mL時達到最高;添加不同濃度E_2 OPN的mRNA和蛋白表達量均有所下降,當E_2濃度為100 ng/mL時達到最低。(5)當P_4濃度為0~25 ng/mL時,OPN蛋白相對濃度隨著P_4濃度的升高而增升高,且當P_4濃度為25 ng/mL時OPN的濃度達到最高,而后OPN蛋白相對濃度隨著濃度的升高而下降;當E_2濃度為0~100 ng/mL時,OPN蛋白相對濃度隨著濃度升高而下降,且當E_2濃度為100 ng/mL其濃度達到最低,而后當E_2濃度為200 ng/mL時其濃度又有所增加。
[Abstract]:In order to study whether steroid hormones are involved in the development of mammal embryos through somatic cells. The effects of P 鈮，

本文編號：2491466