【摘要】：為了研究類固醇激素是否通過體細(xì)胞參于哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育調(diào)控。本文探討了P_4(Progesterone,P_4)和雌二醇(Estradiol,E_2)對(duì)牦牛輸卵管上皮細(xì)胞分泌輸卵管糖蛋白(oviductin,Ovn)及骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)的影響。選用牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,采用組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶消化法獲得牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,運(yùn)用RT-PCR克隆和核酸測(cè)序獲得牦牛骨橋蛋白cDNA;選取第4代牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,分別加入不同濃度的P_4和E_2,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和免疫熒光(Immunofluorescence technique,IF)分別分析P_4和E_2對(duì)體外培養(yǎng)牦牛輸卵管上皮細(xì)胞Ovn和OPN表達(dá)的影響;用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)測(cè)定不同濃度P_4和E_2作用后上清培養(yǎng)液中OPN的濃度。研究結(jié)果表明:(1)當(dāng)P_4濃度為5~25 ng/mL時(shí),隨著P_4濃度的增加Ovn的表達(dá)量也逐漸增高;當(dāng)P_4為25 ng/mL時(shí),Ovn基因和蛋白表達(dá)量為最高;P_4濃度為50~200ng/mL時(shí),Ovn基因和蛋白的表達(dá)量隨著濃度的增加反而逐漸減少。(2)E_2可以提高牦牛輸卵管上皮細(xì)胞的Ovn mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量;當(dāng)E_2濃度為25 ng/mL時(shí),輸卵管上皮細(xì)胞的Ovn mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于E_2濃度為10、50、100和200 ng/mL組;對(duì)照組Ovn mRNA和蛋白表達(dá)量最低。(3)牦牛的OPN與黃牛的同源性最高,達(dá)到99.2%;牦牛與山羊(Capra hircas)、綿羊(Ovis aries)、野豬(Sus scrofa)的相似性分別為93.8%、93.4%、73.6%;牦牛的OPN基因?yàn)?135 bp,包含完整開放閱讀框837 bp,共編碼278個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):KY402045)。(4)體外培養(yǎng)體系中添加不同濃度的P_4,OPN的mRNA和蛋白表達(dá)量均有所增加,且當(dāng)P_4濃度為25 ng/mL時(shí)達(dá)到最高;添加不同濃度E_2 OPN的mRNA和蛋白表達(dá)量均有所下降,當(dāng)E_2濃度為100 ng/mL時(shí)達(dá)到最低。(5)當(dāng)P_4濃度為0~25 ng/mL時(shí),OPN蛋白相對(duì)濃度隨著P_4濃度的升高而增升高,且當(dāng)P_4濃度為25 ng/mL時(shí)OPN的濃度達(dá)到最高,而后OPN蛋白相對(duì)濃度隨著濃度的升高而下降;當(dāng)E_2濃度為0~100 ng/mL時(shí),OPN蛋白相對(duì)濃度隨著濃度升高而下降,且當(dāng)E_2濃度為100 ng/mL其濃度達(dá)到最低,而后當(dāng)E_2濃度為200 ng/mL時(shí)其濃度又有所增加。
[Abstract]:In order to study whether steroid hormones are involved in the development of mammal embryos through somatic cells. The effects of P 鈮，

本文編號(hào)：2491466