【摘要】：赫曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是毒性最大、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品污染最重的赫曲霉毒素,它廣泛存在于糧食、飼料和糧谷類食物等中。OTA具有腎毒性、肝毒性、致畸性、基因毒性、胚胎毒性等。OTA對家禽的毒性較強,主要引起肝臟損傷,但目前多集中于肝損傷癥狀報道,機理研究較少。因此,研究OTA致雞肝細胞損傷病理機制及護肝藥物修復(fù)效應(yīng),具有重要的理論和實踐意義。本文藉體外雞原代肝細胞,研究OTA致雞肝細胞損傷病理演變及常用護肝藥的修復(fù)效應(yīng)及機理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1 OTA誘導(dǎo)雞原代肝細胞損傷最佳劑量的篩選采用改良的二步Ⅳ型膠原酶循環(huán)灌流法,對40-50日齡海藍公雞進行肝細胞的分離培養(yǎng),待培養(yǎng)24h后,細胞貼壁。在貼壁細胞中分別加入0(對照組)、0.25、0.5、1、2、4 μg/mLOTA(n=3),繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后,光學顯微鏡觀察細胞形態(tài),取肝細胞培養(yǎng)上清液,檢測其中ALT、AST的含量,MTT法測定細胞存活率。結(jié)果顯示:對照組細胞貼壁牢固,呈多角形,核圓透亮,細胞聚集成島嶼狀生長,排列整齊。試驗組細胞隨著OTA濃度的增大,細胞數(shù)量逐漸減少,密度下降,部分肝細胞破裂、壞死懸浮于培養(yǎng)基中,剩余細胞結(jié)構(gòu)松散破碎。細胞存活率和ALT、AST的含量呈劑量依賴性的下降和上升。當細胞中加入1 μg/mL OTA培養(yǎng)24 h后,肝細胞存活率為51.33 ±4.27%,細胞上清液中ALT含量極顯著升高(P0.01),AST含量顯著升高(P0.05)。當OTA為2、4 μg/mL時,細胞上清液中ALT、AST含量均極顯著升高(P0.01),細胞存活率較低;而0.25 μg/mLOTA組,與對照組相比,ALT、AST的含量均無顯著性差異。故選擇OTA濃度1 μg/mL作為致雞肝細胞損傷的最佳劑量。2 OTA對雞原代肝細胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡的研究取正常培養(yǎng)24 h的細胞,OTA組中更換含有11μg/mL OTA的培養(yǎng)基(n=3),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞。檢測各組細胞中SOD的活性、GSH和MDA的含量,測定細胞凋亡率及線粒體途徑相關(guān)基因Caspase-3,Bax,bxl-2的表達量。結(jié)果顯示,與對照組相比,1μg/mL OTA可使細胞中SOD的活性和GSH的含量極顯著下降(P0.01),MDA的含量極顯著升高(P0.01),表明OTA可造成肝細胞的氧化應(yīng)激損傷。通過流式細胞儀檢測凋亡率發(fā)現(xiàn),OTA組細胞凋亡率顯著增加(P0.01),可達32.06±2.11%(正常組細胞凋亡率為1.80±0.45%)。OTA組中Caspase-3,Bax表達量極顯著上升(P0.01),Bcl-2表達量顯著降低(P0.05),表明OTA可能是誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡。3復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對OTA致肝細胞損傷保護效應(yīng)3.1復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對肝細胞膜的保護作用取正常培養(yǎng)24h細胞,設(shè)置對照組,OTA致?lián)p組和四種護肝藥物高中低劑量組(0.1、1、10 μg/mL)(n=3)。先加入護肝藥物預(yù)處理,然后加入OTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集各處理組細胞培養(yǎng)上清液,檢測其中ALT、AST含量,MTT法測定細胞存活率,以此研究四種護肝藥物對肝細胞膜的保護作用。結(jié)果顯示,與OTA組相比,復(fù)方甘草酸單胺組和葡醛內(nèi)酯組隨藥物濃度的增大,細胞存活率升高,ALT的含量下降(P0.01),呈現(xiàn)劑量依賴性。但復(fù)方甘草酸單胺各濃度組細胞培養(yǎng)上清液中AST的含量均無顯著變化,但整體呈現(xiàn)下降趨勢,葡醛內(nèi)酯則可使AST顯著下降(P0.01),但各濃度組之間變化趨勢無規(guī)律可循。L-精氨酸組和水飛薊素組與OTA組相比,細胞存活率升高明顯,ALT含量顯著下降(P0.01),但在低濃度下保護效果較好。水飛薊素組中AST含量顯著下降(P0.01),但變化無規(guī)律,L-精氨酸組則是在1 μg/mL濃度下,AST含量下降最明顯(P0.05)。此結(jié)果表明,復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素和葡醛內(nèi)酯均有保護肝細胞膜的作用。3.2復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯的抗氧化作用取正常培養(yǎng)24h細胞,設(shè)置對照組,OTA致?lián)p組和1 μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1 μg/mL L-精氨酸組、1 μg/mL水飛薊素組、1 μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)。預(yù)先加入護肝藥物處理,再加入1 μg/mL OTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集各組細胞,檢測細胞中SOD活性和GSH、MDA的含量。結(jié)果顯示,與OTA組相比,四種護肝藥物組均可升高SOD活性和GSH含量,降低細胞中MDA含量(P0.05),其中尤以水飛薊素作用效果最好,此可表明四種護肝藥物均可通過抗氧化作用來抑制OTA導(dǎo)致的肝損傷。3.3復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)醋對肝細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測對照組,OTA致?lián)p組和1 μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1 μg/mLL-精氨酸組、1 μg/mL水飛薊素組、1 μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)中細胞的調(diào)亡率,熒光定量PCR檢測線粒體調(diào)亡途徑相關(guān)基因Caspase-3,Bcl-2,Bax的表達。結(jié)果顯示,與OTA組相比,經(jīng)四種護肝藥物預(yù)處理后,細胞凋亡率下降顯著(P0.05),尤以水飛薊素和復(fù)方甘草酸單胺抑制凋亡作用明顯。四種護肝藥均可在一定程度上降低Caspase-3,升高Bcl-2的表達,但L-精氨酸和葡醛內(nèi)酯對Bax的表達量無明顯降低作用,表明復(fù)方甘草酸單胺和水飛薊素可能是通過抑制線粒體途徑的凋亡來達到保護肝細胞的作用,而L-精氨酸和葡醛內(nèi)酯則可通過改變Caspase-3和Bcl-2的表達來抑制細胞凋亡,但具體機制仍需進一步研究。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：2489719