【摘要】：豬細(xì)小病毒是一種主要引起母豬繁殖障礙的病原,懷孕母豬感染豬細(xì)小病毒可能會出現(xiàn)返情、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎、產(chǎn)弱仔等臨床癥狀。除了能引起母豬繁殖障礙外,豬細(xì)小病毒還能引起哺乳仔豬非化膿性心肌炎、仔豬滲出性皮炎、育肥豬間質(zhì)性腎炎等疾病,另外與豬圓環(huán)病毒共同感染能夠加重仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。本實驗室從一育肥豬早、中期生產(chǎn)水平較差的豬場收集不同年齡段的育肥豬血清214份,用DNA提取試劑盒提取血清中的DNA,設(shè)計豬細(xì)小病毒特異性引物對214份血清DNA進(jìn)行核酸檢測,并選取其中7份經(jīng)PCR檢測為豬細(xì)小病毒陽性的血清用ST細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,盲傳3代后,將病毒液凍融三次,用豬細(xì)小病毒特異性引物對7份血清接種的細(xì)胞液進(jìn)行PCR鑒定,其中一份血清檢測到了目的條帶。確定分離到一株豬細(xì)小病毒,命名為PPV-16WS。通過觀察細(xì)胞病變、測定血凝效價、分析部分全基因序列等方法研究病毒特性。結(jié)果顯示,該病毒傳至第5代能夠出現(xiàn)較穩(wěn)定的細(xì)胞病變,血凝效價能達(dá)到28,對其部分全基因組進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)與GenBanK收錄的傳統(tǒng)的PPV序列同源性較高,其中與2012年時樂分離的YL株同源性最高,達(dá)到了99.0%,表明16WS是PPV。本研究建立檢測PPV實時熒光定量PCR方法,為PPV病毒的初步定量檢測奠定了基礎(chǔ)。并對實驗室分離株16WS進(jìn)行傳代對其培養(yǎng)條件進(jìn)行摸索,主要包括：ST細(xì)胞生長狀態(tài)、病毒孵育時間、細(xì)胞密度、病毒接種量、病毒收毒時間、培養(yǎng)體積、有無二氧化碳等條件,希望通過優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件來提高病毒滴度。結(jié)果顯示：將生長48h的ST細(xì)胞傳代12h后待細(xì)胞密度為60%(6.0-7.5×106cells/ml)時,進(jìn)行分步接毒,孵育1h,接種量為107copies/ml,六孔板培養(yǎng)體積為2ml,放置5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h,病毒滴度最高,能夠穩(wěn)定在3.59×109copies/ml左右。
[Abstract]:Pig parvovirus is a kind of pathogen which mainly causes reproductive disorder of sows. Pregnant sows infected with pig parvovirus may have clinical symptoms such as return, abortion, stillbirth, mummification, weak birth and so on. In addition to causing reproductive disorders in sows, swine parvovirus can also cause non-suppurative myocarditis, exudative dermatitis in piglets, interstitial nephritis in fattening pigs and other diseases. In addition, co-infection with pig circovirus can aggravate multisystem failure syndrome in piglets. In our laboratory, 214 serum samples of fattening pigs of different ages were collected from a pig farm with poor production level in the early and middle stages of fattening pigs, and DNA, in serum was extracted by DNA extraction kit. The nucleic acid of 214 serum DNA samples was detected by designing specific primers of pig parvovirus, and 7 of them were detected by PCR and isolated with ST cells. After blind transmission for 3 generations, the virus solution was frozen and thawed three times. The cell fluid inoculated with 7 serum samples was identified by PCR with Porcine parvovirus specific primers, and the target band was detected in one of the seven serum samples. A strain of Porcine Parvovirus named PPV-16WS. was identified. The characteristics of the virus were studied by observing the cytopathic effect, measuring the hemagglutination titer and analyzing the whole gene sequence. The results showed that the virus could produce stable cytopathic effect and the hemagglutination titer could reach 28. Some of the whole genome was sequenced and found to have high homology with the traditional PPV sequence included in GenBanK. Among them, the homology with the YL strain isolated in 2012 was the highest, reaching 99.0%, indicating that 16WS was PPV.. In this study, a real-time fluorescence quantitative PCR method for the detection of PPV was established, which laid a foundation for the preliminary quantitative detection of PPV virus. The culture conditions of laboratory isolate 16WS were explored, including ST cell growth state, virus incubation time, cell density, virus inoculum size, virus collection time, culture volume, carbon dioxide and so on. It is hoped that the virus titer can be improved by optimizing the culture conditions of the virus. The results showed that after passage of ST cells for 48 h for 12 h, when the cell density was 60% (6.0 脳 7.5 脳 106cells/ml), the cells were incubated step by step for 1 h, the inoculum size was 107 copies / ml, and the culture volume of six-well plate was 2 ml. When cultured in 5% carbon dioxide incubator for 72 hours, the virus titer was the highest and could be stabilized at about 3.59 脳 109copies/ml.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：2484528