【摘要】：卵母細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育和成熟是現(xiàn)代生殖生物學(xué)研究的核心和基礎(chǔ),其中,卵母細(xì)胞的成熟是生殖發(fā)育研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。影響卵母細(xì)胞成熟的因素很多,其中卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞是影響卵母細(xì)胞成熟的核心要素,裸卵是指周圍未經(jīng)卵丘細(xì)胞完整包裹的卵母細(xì)胞,尚未被利用,是一種潛在的卵源。裸卵體外成熟率及后續(xù)發(fā)育潛力較低。目前未見裸卵體外成熟獲得個(gè)體的報(bào)道,這不僅制約著裸卵體外成熟培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展,也制約著卵母細(xì)胞資源的充分利用。Forskolin能夠抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),而PD166285能夠推動(dòng)MPF的合成,從而促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)。紡錘體的組裝及皮質(zhì)顆粒的分布可作為評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)生,是一個(gè)極為復(fù)雜的細(xì)胞分化過程,易受到外界環(huán)境的影響。應(yīng)激尤其是熱應(yīng)激對(duì)個(gè)體產(chǎn)生的最大問題之一就是它對(duì)生殖功能的損傷作用。但是熱應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量,卵丘細(xì)胞包裹、凋亡情況以及裸卵的產(chǎn)生關(guān)系未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究以小鼠為研究對(duì)象,通過短時(shí)添加forskolin以抑制胞核成熟進(jìn)程,再添加PD166285促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù),觀察forskolin及PD166285對(duì)卵母細(xì)胞成熟效率,并檢測(cè)成熟卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒分布及紡錘體組裝,觀察其對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。并通過IVF-ET進(jìn)一步檢測(cè)體外成熟裸卵的后續(xù)發(fā)育能力。并對(duì)小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激處理,通過蘇木精伊紅染色法及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)法觀察卵巢上卵母細(xì)胞包裹的卵丘細(xì)胞的衰退與凋亡的情況,試圖揭示熱應(yīng)激與小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量衰退,裸卵產(chǎn)生之間的聯(lián)系。具體試驗(yàn)和結(jié)果如下:試驗(yàn)一目的是探討添加forskolin及PD166285對(duì)裸卵成熟效率及皮質(zhì)顆粒分布、紡錘體組裝影響。將體外取得的未成熟的GV期裸卵隨機(jī)分配為添加forskolin、PD及不添加兩組。統(tǒng)計(jì)不同成熟方式下裸卵的成熟率,隨后檢測(cè)成熟卵母細(xì)胞紡錘體組裝及皮質(zhì)顆粒分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加藥組不加藥組均能完成體外成熟過程,加藥組裸卵體外成熟率高于不加藥組;對(duì)照組卵母細(xì)胞,其紡錘體呈對(duì)稱的“紡錘形”。不加藥組紡錘體結(jié)構(gòu)松散,呈“桶狀”分布,體內(nèi)成熟組,皮質(zhì)顆粒皮層分布模式所占比例顯著高于體外成熟各組。以上結(jié)果說明,添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率,并對(duì)成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量有一定提升。試驗(yàn)二旨在探明裸卵通過體外成熟受精后生產(chǎn)小鼠的可能。將卵巢上獲取的裸卵體外加藥培養(yǎng)成熟,并通過體外授精技術(shù)使其受精并發(fā)育到2-細(xì)胞期后,將2-細(xì)胞胚胎通過輸卵管胚胎移植法移入假孕0.5dpc的受體雌鼠體內(nèi),并使其繼續(xù)發(fā)育。我們通過本試驗(yàn)首次獲得了由裸卵體外成熟受精生產(chǎn)出的小鼠。證明裸卵具有發(fā)育為個(gè)體的潛力。試驗(yàn)三旨在揭示熱應(yīng)激與小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量衰退及裸卵的產(chǎn)生之間的聯(lián)系。將小鼠均分為HS-12d、HS-9d、HS-6d、HS-3d及CON五組,每組12只,分別對(duì)其進(jìn)行頻率和時(shí)間不同的高強(qiáng)度熱應(yīng)激。處理完成后,制作卵巢石蠟切片。利用HE染色及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)觀察小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)及其包裹的卵丘細(xì)胞的衰退與凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著高于各熱處理組,差異均顯著(P0.05)。卵巢上周圍卵丘細(xì)胞包裹2-5層的卵母細(xì)胞數(shù)量,對(duì)照組要顯著高于其與各實(shí)驗(yàn)組(P0.05)。TUNEL凋亡檢測(cè)顯示,對(duì)照組凋亡率要顯著低于各熱應(yīng)激處理組,差異均顯著(P0.05)。結(jié)果表明,熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致裸卵的產(chǎn)生。綜上所述,本文通過裸卵體外成熟過程中與forskolin、PD166285共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率,并對(duì)成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量有一定提升,同時(shí)證明紡錘體的組裝及皮質(zhì)顆粒分布可用于評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)量。為后續(xù)提高裸卵的成熟率及卵母細(xì)胞胞質(zhì)檢測(cè)提供一定的參考。再通過體外受精-胚胎移植首次獲得了由裸卵體外成熟受精得到的具有正常功能的后代小鼠。證明了裸卵在適當(dāng)條件下也具有繁殖后代的潛能,為畜禽生產(chǎn)提供更為廣闊的卵母細(xì)胞來源,同時(shí)也為治療現(xiàn)代不孕不育提供一定幫助。并進(jìn)一步研究了熱應(yīng)激對(duì)哺乳動(dòng)物卵巢衰退及裸卵的產(chǎn)生、卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響,對(duì)裸卵的產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行初步探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S814

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本文編號(hào)：2470598