【摘要】：口服給藥是獸醫(yī)臨床上重要的給藥途徑之一,而口服給藥發(fā)揮藥物療效的前提是藥物能透過胃腸道細(xì)胞膜進(jìn)入體循環(huán)。研究表明小腸上皮細(xì)胞膜上高表達(dá)的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)可以限制藥物的口服吸收,降低口服藥物生物利用度。因此篩選安全有效的P-gp抑制劑以提高口服藥物生物利用度已成為藥物制劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。黃連素是常用的抗感染治療藥物。已有研究表明黃連素對(duì)大鼠P-gp表達(dá)和功能具有一定影響,但也未深入研究,而黃連素對(duì)肉雞組織中P-gp表達(dá)及功能的影響尚未見報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。因此本實(shí)驗(yàn)研究了黃連素對(duì)肉雞小腸組織P-gp表達(dá)和功能的影響,并初步探討了黃連素引起P-gp表達(dá)變化與核受體CXR、CAR和PXR的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)首先克隆了 AA肉雞Abcb1全序列,并采用生物信息學(xué)軟件分析了該基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn),繪制物種間的進(jìn)化樹。酶切和測(cè)序的結(jié)果證實(shí)雞的Abcb1基因被成功克隆并被重組至質(zhì)粒pcDNA3.1中。生物信息學(xué)分析顯示:肉雞Abcb1基因的CDS全長為3867 bp,編碼1288個(gè)氨基酸,與火雞、鴨、人、豬、牛和羊的氨基酸序列同源性較高,分別為95%、74%、72%、72%、68%和72%。PROTTER軟件預(yù)測(cè)肉雞Abcb1編碼蛋白P-gp的跨膜結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其與人P-gp結(jié)構(gòu)相似,均有12個(gè)跨膜螺旋,分為兩個(gè)跨膜區(qū)和兩個(gè)胞內(nèi)的核苷酸結(jié)合區(qū)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示肉雞P-gp可能存在7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),而人P-gp可能存在10個(gè)。進(jìn)化樹分析顯示雞與火雞的P-gp同屬一個(gè)分枝,而與人和其他哺乳動(dòng)物如豬、牛的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。然后我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建高表達(dá)肉雞P-gp的MDCK-chAbcb1細(xì)胞系,并對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)功能和特性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)通過Lipfactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建的pcDNA3.1-chAbcb1真核質(zhì)粒導(dǎo)入MDCK細(xì)胞中,選用潮霉素B進(jìn)行篩選獲得單克隆細(xì)胞株。采用RT-PCR、免疫組化和免疫熒光對(duì)細(xì)胞中P-gp的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和分析,最后通過Rho123的蓄積和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建細(xì)胞系的轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行鑒定。RT-PCR結(jié)果顯示構(gòu)建的過表達(dá)MDCK-chAbcb1細(xì)胞中能檢測(cè)到肉雞Abcb1的mRNA表達(dá),免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示P-gp (Abcb1編碼蛋白)定位于細(xì)胞膜上,且P-gp在MDCK-chAbcb1細(xì)胞中的表達(dá)量較MDCK-pcDNA3.1細(xì)胞顯著升高(約3倍)。Rho123蓄積實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其在MDCK-chAbcb1中的熒光強(qiáng)度顯著低于MDCK-pcDNA3.1細(xì)胞,尤其在孵育10、20和50min后差異極顯著(P0.01),而與Caco-2細(xì)胞中的蓄積量相比,略有升高,但無顯著差異(P0.05)。采用P-gp抑制劑維拉帕米作用后,Caco-2和MDCK-chAbcb1細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積量均隨時(shí)間延長而顯著升高,且在20和50 min時(shí)差異顯著(P0.05),而MDCK-pcDNA3.1細(xì)胞中Rho123蓄積量未見顯著變化(P0.05)。進(jìn)一步比較了肉雞和人P-gp對(duì)Rho123轉(zhuǎn)運(yùn)特性,發(fā)現(xiàn)MDCK-chAbcb1對(duì)Rho123存在兩個(gè)親和位點(diǎn),米氏常數(shù)(Km)分別為0.73±0.03和51.75±9.20μM,最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率(Vmax)分別是0.87±0.05和10.14±1.10 nmol/mgprotein/min。Caco-2細(xì)胞對(duì)Rho123只有一個(gè)親和位點(diǎn),米氏常數(shù)和最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率分別為 2.38±0.06 mM 和 22.8±2.74 pmol/mg protein /min。Caco-2 和 MDCK-chAbcb1 細(xì)胞對(duì)Rho123 的Pappb-a 分別為 72.33±4.48 和 54.42±4.36,顯著高于對(duì)照 MDCK-pcDNA3.1 細(xì)胞(11.35±1.81 ),外排率ER分別為7.49和6.24,也顯著高于對(duì)照MDCK-pcDNA3.1 (1.64 )。上述結(jié)果證實(shí)肉雞P-gp在MDCK-chAbcb1細(xì)胞中高表達(dá),其與底物Rho123的結(jié)合特性與Caco-2細(xì)胞存在差異,但其轉(zhuǎn)運(yùn)Rho123的能力與Caco-2的轉(zhuǎn)運(yùn)能力相當(dāng)。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步采用跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)合高壓液相色譜方法比較了維拉帕米和黃連素對(duì)Caco-2和MDKC-chAbcb1細(xì)胞P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。結(jié)果顯示維拉帕米(0.01-5 mM)作用Caco-2和MDKC-chAbcb1細(xì)胞后,Rho123從基底側(cè)(BL)到頂側(cè)(AP)的轉(zhuǎn)運(yùn)均受到抑制,且呈現(xiàn)濃度依賴性,而從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量雖有升高趨勢(shì),但無顯著性變化(P0.05)。其中0.1、1和5 mM的維拉帕米對(duì)MDKC-chAbcb1細(xì)胞外排Rho123的抑制率分別為43.8%、68.9%和78%,對(duì)Caco-2細(xì)胞外排Rho123的抑制率分別為45.7%、61.1%和71.4%。不同濃度的黃連素(5、20和40μM)處理MDCK-chAbcb1細(xì)胞不同時(shí)間后,Rho123從BL到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)均受到抑制,并且隨著抑制時(shí)間延長,其對(duì)Rho123外排抑制率也逐漸升高。上述結(jié)果表明,P-gp的經(jīng)典抑制劑維拉帕米對(duì)肉雞P-gp同樣具有較好的抑制作用,而一定濃度的黃連素可以抑制MDCK-chAbcb1細(xì)胞中P-gp對(duì)Rho123的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),推測(cè)其可作為潛在的P-gp抑制劑進(jìn)一步開發(fā)利用。為了進(jìn)一步證實(shí)黃連素對(duì)肉雞腸道P-gp的功能存在抑制作用,采用肉雞回腸部位進(jìn)行了Rho123的在體灌流實(shí)驗(yàn)。將6周齡AA肉雞用不同劑量的黃連素(40和80mg/kg.bw)分別處理1天和3天后于回腸部位進(jìn)行Rho123的在體灌流實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明40和80 mg/kg.bw的黃連素處理1天后,其吸收常數(shù)Ka分別為1.87和2.25 min-1,與對(duì)照組(1.12 min-1)相比顯著升高(P0.05 )。而表觀滲透率(Papp)分別為0.0132和0.0076 cm·min-1,與對(duì)照組(0.0074 cm·min-1)相比差異不顯著(P＞0.05 )。但是相應(yīng)濃度黃連素連續(xù)灌服肉雞3天后,其Ka和Papp(cm·min-1)與對(duì)照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果提示一定劑量的黃連素短時(shí)間內(nèi)給予肉雞后對(duì)其回腸P-gp的外排確實(shí)有抑制作用,且該結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,再次佐證黃連素對(duì)肉雞回腸P-gp功能的抑制作用。最后本論文進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步探討了黃連素對(duì)P-gp表達(dá)影響是否與核受體CXR、CAR和PXR存在關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)首先采用不同濃度的黃連素分別處理MDCK-chAbcb1細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞,然后采用realtimeRT-PCR方法檢測(cè)了樣品中Abcb1、PXR、CAR和CXRmRNA相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定結(jié)果顯示5 pM黃連素處理Caco-2細(xì)胞1-12h內(nèi),未對(duì)Abcb1 mRNA產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05 ),但處理24 h后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著上升(P0.05);而該濃度的黃連素處理MDCK-chAbcb1細(xì)胞4-24 h時(shí)Abcb1 mRNA表達(dá)受到持續(xù)抑制。當(dāng)黃連素濃度增加至20 μM時(shí),其對(duì)Caco-2細(xì)胞中Abcb1 mRNA表達(dá)也表現(xiàn)出抑制作用,尤其在1-8 h內(nèi)表現(xiàn)出顯著抑制(P0.05 ),但在12 h后其表達(dá)量開始恢復(fù);而該濃度黃連素作用4 h后對(duì)MDCK-chAbcb1 mRNA表達(dá)表現(xiàn)為顯著的抑制作用(P0.05);當(dāng)黃連素劑量再繼續(xù)增加至40μM時(shí),作用細(xì)胞1h即開始顯著抑制(P0.05)Abcb1的mRNA表達(dá)。采用免疫熒光方法檢測(cè)相應(yīng)濃度黃連素分別處理兩種細(xì)胞后P-gp表達(dá)水平的變化,表現(xiàn)出與mRNA變化相似的結(jié)果。進(jìn)一步探討黃連素對(duì)Caco-2細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的核內(nèi)受體mRNA表達(dá)水平的變化,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中CAR mRNA表達(dá)變化與Abcb1 mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)相似,呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。最后肉雞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定劑量的黃連素(40, 80 mg/kg)處理肉雞1天時(shí)對(duì)肉雞回腸中Abcb1和CXR mRNA表達(dá)水平有顯著的抑制作用(P0.05),呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性,并且與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致;但高劑量黃連素(80 mg/kg)連續(xù)處理肉雞3天時(shí)對(duì)肉雞Abcb1和CXR mRNA表達(dá)水平影響卻不顯著(P＞0.05 )。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示黃連素對(duì)哺乳動(dòng)物腸道細(xì)胞和肉雞小腸Abcb1的表達(dá)能產(chǎn)生一定的抑制作用,但該作用強(qiáng)度在不同細(xì)胞存在差異,且與用藥濃度和給藥時(shí)機(jī)存在一定關(guān)系,并推測(cè)黃連素對(duì)Abcb1的抑制作用可能受核內(nèi)受體CAR (Caco-2細(xì)胞)和CXR (肉雞)調(diào)控,具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。綜上結(jié)果,我們成功地構(gòu)建了功能性高表達(dá)雞源P-gp的MDCK-chAbcb1細(xì)胞,可用于評(píng)價(jià)藥物間相互作用及篩選P-gp抑制劑,同時(shí)證明黃連素對(duì)雞源P-gp的表達(dá)和功能存在抑制作用;并推測(cè)黃連素的抑制作用可能受核內(nèi)受體CAR (Caco-2細(xì)胞)和CXR (雞)調(diào)控,但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果豐富了雞P-gp蛋白研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論和數(shù)據(jù)庫,并為研究獸藥間相互作用提供了技術(shù)平臺(tái)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S859.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2462834