【摘要】：傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)為雙病毒科雙病毒屬的病毒,可引起雛雞感染的急性高致病性傳染病傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),該傳染病主要以免疫抑制為特征。該病毒上的VP2擔(dān)當(dāng)其主要的結(jié)構(gòu)蛋白,構(gòu)成IBDV衣殼的外層,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,且具有血清型特異性。另外導(dǎo)致其毒力變異的重要因素也是由VP2高變區(qū)的氨基酸殘基突變而引起的。因此VP2基因成為IBDV的免疫防制、遺傳變異和繁殖機(jī)制的重要基因。IgY是存在于鳥類及爬行動(dòng)物血清中的主要抗體。人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物IgG Fc段可增加疫苗中抗原的血清半衰期,并增強(qiáng)抗原捕獲的速度和效率,而對(duì)于與哺乳動(dòng)物IgG相似結(jié)構(gòu)及功能的禽IgY是否有類似功能目前鮮有研究。免疫佐劑因其可以激活先天免疫系統(tǒng)繼而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)特異性抗原的適應(yīng)性免疫從而促使機(jī)體產(chǎn)生高效持久的免疫反應(yīng),所以在疫苗使用過程中占據(jù)重要的地位。本實(shí)驗(yàn)室前期前期結(jié)果表明泰山松花粉多糖(Taishan pinus massoniana pollen polysaccharide,TPPPS)具有良好的免疫效果,可作為優(yōu)質(zhì)免疫佐劑使用,但其對(duì)本研究中的融合蛋白的免疫增強(qiáng)效果情況還未有報(bào)道。因此,本研究探究了連接上IgY Fc的VP2融合蛋白是否能增強(qiáng)亞單位疫苗免疫原性以及泰山松花粉多糖對(duì)VP2-Fc融合蛋白的免疫效果的增強(qiáng)作用兩大方面的問題。本研究根據(jù)Genbank發(fā)表的IBDV VP2基因序列和雞IgY的Fc段基因序列,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物,利用SOE-PCR技術(shù)擴(kuò)增出IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因和IgY Fc的融合基因。將融合基因重組于pMD18-T中構(gòu)建克隆質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定后再進(jìn)行雙酶切重組克隆質(zhì)粒,將獲得的VP2-Fc融合基因片段重組于pPIC9真核表達(dá)載體后經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng),篩選出陽性子進(jìn)行培養(yǎng)并以甲醇為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別于24h、48h、72h和96h取樣,樣本進(jìn)行SDS-PAGE和Westem blotting等方法檢測重組質(zhì)粒表達(dá)量以及表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。結(jié)果表明,重組VP2-Fc融合蛋白具有免疫原性,畢赤酵母培養(yǎng)至72h時(shí)表達(dá)量最高。動(dòng)物試驗(yàn)中,將240只SPF雞隨機(jī)分為6組,3日齡首免,分別頸部皮下接種0.2 m L VP2-Fc-TPPPS(40mg/mL)、VP2-Fc-TPPPS(25mg/mL)、VP2-Fc-TPPPS(10mg/mL)、VP2-Fc、VP2亞單位疫苗和PBS,于首免后7和14 d分別進(jìn)行加強(qiáng)免疫。每組分別在首免后的3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49 d隨機(jī)取3只雞進(jìn)行采血并檢測其血清的抗體效價(jià)、白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)、外周血CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞含量以及T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。三免后1周,每組隨機(jī)取20只雞進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn),連續(xù)7 d觀察并記錄臨床癥狀和保護(hù)率。結(jié)果表明,VP2-Fc亞單位疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗-VP2抗體,分泌IL-2、IL-4、IFN-γ,提高CD4+T、CD8+淋巴細(xì)胞百分含量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,并能提供92%的保護(hù)率。此外,TPPPS佐劑疫苗能顯著提高機(jī)體免疫反應(yīng)水平。該研究為研發(fā)生產(chǎn)新型有效的IBDV亞單位疫苗及泰山松花粉多糖做免疫佐劑提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2454676