【摘要】：乳酸菌是公認(rèn)的安全級(jí)(generally recognized as safe,GRAS)微生物,是動(dòng)物腸道內(nèi)重要的常在菌群,對(duì)維持腸道菌群平衡、改善便秘、防止腹瀉以及提高機(jī)體免疫力具有重要作用�；谌樗峋亩喾N益生特點(diǎn),使其成為傳遞與表達(dá)外源抗原蛋白,進(jìn)行腸道免疫的的重要宿主候選菌株。目前,乳酸菌級(jí)表達(dá)載體多以誘導(dǎo)型為主,由于表達(dá)異源蛋白的產(chǎn)量較低且不利于生產(chǎn)實(shí)踐,從而限制了其應(yīng)用。通過(guò)改造控制基因表達(dá)的順式作用元件是提高蛋白表達(dá)量的有效途徑,而啟動(dòng)子在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中居于關(guān)鍵地位,因此穩(wěn)定且可持續(xù)表達(dá)目的蛋白的組成型啟動(dòng)子是構(gòu)建表達(dá)載體非常重要的表達(dá)元件。本研究以干酪乳桿菌為研究對(duì)象,通過(guò)干酪乳桿菌基因組c DNA微陣列分析,以尋找適用于異源蛋白表達(dá)的組成型啟動(dòng)子。將干酪乳桿菌在分別以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖為碳源的MRS培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)接5次,提取細(xì)菌總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以16S RNA作為管家基因,進(jìn)行全基因組c DNA微陣列分析。分析結(jié)果顯示,以上述八種糖為碳源,干酪乳桿菌丙酮酸水合酶(enolase)基因皆為高表達(dá)基因,據(jù)此我們推測(cè)干酪乳桿菌丙酮酸水合酶基因含有組成型啟動(dòng)子。通過(guò)分析丙酮酸水合酶基因的上游基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)軟件確定了兩段假定啟動(dòng)子序列,分別命名為P776和P342。分別將P776和P342與報(bào)告基因EGFP連接,然后連接到去除啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPG-P342EGFP和p PG-P776EGFP。為了驗(yàn)證所預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱,與原表達(dá)質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT的HCE啟動(dòng)子進(jìn)行了比較,將EGFP編碼基因連入表達(dá)質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPG-T7g10-EGFP。分別將重組表達(dá)質(zhì)粒pPG-P342EGFP、pPG-P776EGFP和p PG-T7g10-EGFP經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入Lactobacillus(L)casei 393感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了重組菌pPG-P776EGFP/L.casei 393、pPG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393,通過(guò)Western blot、熒光定量PCR、流式細(xì)胞技術(shù)及激光共聚焦等方法,檢測(cè)報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況。構(gòu)建的重組乳酸桿菌表達(dá)結(jié)果顯示,由不同啟動(dòng)子組成的三株重組乳酸菌經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察均可看到綠色熒光,Western blot檢測(cè)EGFP獲得了正確表達(dá),大小約26k Da,說(shuō)明預(yù)測(cè)的P342和P776均具有啟動(dòng)子活性。為比較P342和P776與原表達(dá)載體HCE啟動(dòng)子的活性強(qiáng)弱,提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三株重組菌RNA,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物c DNA為模板及氯霉素(Cm)基因?yàn)楣芗一?進(jìn)行相對(duì)定量PCR,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HCE:P342:P776 3種啟動(dòng)子的效率比分別為1:0.8:1.8;Western blot相對(duì)定量結(jié)果顯示,三株重組菌中,p PG-P776EGFP/L.casei393目的蛋白的表達(dá)量最大;流式細(xì)胞檢測(cè)顯示,L.casei 393、p PG-P342EGFP/L.casei 393、pPG-P776EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393的熒光強(qiáng)度分別為30.2%、38.5%、52.2%和45.2%;將p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei 393分別培養(yǎng)12h、18h、24h、30h和36h,Western blot檢測(cè)顯示,P342和P776啟動(dòng)子均可持續(xù)啟動(dòng)蛋白表達(dá),培養(yǎng)24h時(shí)蛋白的表達(dá)量最大;分別以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖為碳源培養(yǎng)p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei393,經(jīng)Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示組成型啟動(dòng)子P342和P776在不同糖類為碳源的培養(yǎng)基中均能啟動(dòng)報(bào)告基因EGFP的表達(dá),其中P776啟動(dòng)子活性強(qiáng)于HCE啟動(dòng)子,本研究為構(gòu)建乳酸菌級(jí)高效表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.6

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 曾珠;陳麗麗;左芳雷;趙偉;陳尚武;;乳酸菌中糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2013年10期

2 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 周燾;張銳;楊大偉;郭三堆;;棉花綠色組織特異性啟動(dòng)子的高效表達(dá)研究[A];中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2010年年會(huì)論文匯編[C];2010年

2 孫國(guó)清;張銳;孟志剛;閆喜中;劉東軍;胡建斌;耿青山;管敏;白瑋;馮娜;郭三堆;;Nodolin-like基因的構(gòu)建及功能驗(yàn)證[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陳佩佩;乳酸桿菌丙酮酸水合酶基因組成型啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)及功能鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 胡于東;氧化葡萄糖酸桿菌梯度強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子的篩選與應(yīng)用[D];江南大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2447144