【摘要】：將精子載體轉基因法(SMGT)與單精注射(ICSI)結合制備轉基因動物是一種新的轉基因技術,研究歷史較短,但其可行性和高效性已在多個物種得到試驗證實。隨著胚胎生物技術的發(fā)展,對體外成熟卵母細胞的質量要求日益增加。目前通過體外培養(yǎng)獲得成熟卵母細胞,其胞質成熟度還是不及體內的成熟卵母細胞,影響卵母細胞體外成熟質量的因素有體外成熟培養(yǎng)的時間控制、體外成熟培養(yǎng)液中不同添加物、卵母細胞獲取方法和卵母細胞質量等等。因此需對這些環(huán)節(jié)進行優(yōu)化研究,本實驗為研究如何在眾多的卵母細胞中挑選出合適的卵母細胞用于體外成熟培養(yǎng),為了能夠獲得更多優(yōu)質的卵母細胞。以體外成熟的豬卵母細胞為材料,對豬卵母細胞體外受精和孤雌激活等相關問題進行了初步研究,同時也探索了單精子顯微注射技術制備胚胎的研究。實驗內容有抽取豬卵母細胞根據(jù)卵丘細胞的層數(shù)及完整性將卵母細胞分成A、B、C三組,并分別進行體外成熟培養(yǎng),體外成熟44h觀察卵母細胞第一極體的排出情況,試驗結果:A、B、C三組卵母細胞的第一極體排出率分別為(68.94%vs47.94%vs31.65%),結果表明A組卵母細胞的的第一極體排出率明顯高于B、C兩組,且A組和B組差異極顯著(p0.01),A組和C組pbI排出率差異極顯著(p0.0]),B組和C組pbI排出率差異極顯著(p0.01)。A、B、C三組卵母細胞進行孤雌激活實驗,在體外培養(yǎng)24-48h觀察卵裂情況,體外培養(yǎng)5-6d觀察囊胚情況,實驗數(shù)據(jù)結果為A、B、C三組卵母細胞培養(yǎng)24-48h后得到的卵裂率分別為87.72%,82.38%,52.94%。A、B組卵母細胞的卵裂率差異不顯著(p0.05),A、C組卵母細胞的卵裂率差異極顯著(p0.0]),B、C組卵母細胞差異極顯著(p0.01)。A、B、C三組卵母細胞體外培養(yǎng)第5-6d的時候囊胚率分別為10.96%,6.21%,2.88%。A組卵母細胞囊胚率高于B組和C組,A組和C組差異顯著(p0.05),B組囊胚率高于C組,差異顯著(p0.05)。不同級別的成熟卵母細胞進行體外受精后,A組卵母細胞的囊胚率(10.61%)明顯高于B組囊胚率(5.34%)和C組囊胚率(3.58%),A組和B組卵母細胞的囊胚率差異極顯著(P0.01),B組和C組卵母細胞的囊胚率差異不顯著(P0.05)。這一結果表明了卵丘細胞對卵母細胞體外受精受精卵胚胎的發(fā)育有影響。④進行了豬卵母細胞胞質內單精子顯微注射制備胚胎的實驗,并作出了改進,實驗成功的制備出6枚受精卵囊胚,此試驗為制備轉基因豬研究奠定基礎。結論:卵丘細胞對卵母細胞的體外成熟和胚胎發(fā)育有促進作用,選擇3層以上包裹致密的卵丘-卵母細胞復合體體外成熟效果更好。單精子顯微注射制備豬胚胎的實驗成功的制備6枚受精卵囊胚。
[Abstract]:It is a new transgenic technology to prepare transgenic animals by combining (SMGT) with single sperm injection (ICSI), but its feasibility and efficiency have been proved by experiments in many species. With the development of embryo biotechnology, the quality of oocytes matured in vitro is increasing day by day. At present, the cytoplasmic maturity of mature oocytes obtained by in vitro culture is still less than that of mature oocytes in vivo, and the factors affecting the quality of in vitro maturation of oocytes are controlled by the time of in vitro maturation culture. In vitro maturation medium, different additives, methods of oocyte acquisition and oocyte quality, and so on. Therefore, these links need to be optimized. The purpose of this experiment is to study how to select suitable oocytes from a large number of oocytes for in vitro maturation culture in order to obtain more high-quality oocytes. In this paper, the in vitro fertilization and parthenogenetic activation of porcine oocytes were studied using porcine oocytes matured in vitro. At the same time, the preparation of embryos by single sperm microinjection was also explored. According to the number and integrity of cumulus cells, porcine oocytes were divided into three groups: group A, group B, and group C. The oocytes were cultured in vitro and matured in vitro for 44 hours to observe the efflux of the first polar body of oocytes. The results showed that the first polar body efflux rate of oocytes in A, B and C groups were 68.94% vs 47.94% vs 31.65%, respectively. The results showed that the first polar body efflux rate of oocytes in A group was significantly higher than that in B and C groups. There was a significant difference between group A and group B (p0.01), A group and C group; p0.0]), B group and C group had significant difference in pbI efflux rate (p0.01). A, B, A, B, P < 0.01, P < 0.01). The parthenogenetic activation test of oocytes in group C was performed. The cleavage of oocytes was observed for 24 hours in vitro, and blastocysts were observed for 5 days after culture in vitro. The results were as follows: a, B, A, B. The cleavage rate of oocytes in group C was 87.72%, 82.38% and 52.94% respectively after 24 h culture. There was no significant difference in cleavage rate between group A and group B (p0.05), A,). The cleavage rate of oocytes in group C was significantly different (p0.0), that in group B was significantly different from that in group C (p0.01). The blastocyst rate of oocytes in group A, B and C was 10.96% at the 5th to 6th day of culture, respectively, and the blastocyst rate of oocytes in group C was 10.96% after 5-6 days of culture. The oocyte blastocyst rate in group A was higher than that in group B and C, and there was significant difference between group A and group C (p0.05), B group was higher than that in group C (p0.05). The rate of blastocyst of group A (10.61%) was significantly higher than that of group B (5.34%) and group C (3.58%) after in vitro fertilization of mature oocytes of different grades, and the blastocyst rate of group A (10.61%) was significantly higher than that of group B (5.34%) and C (3.58%). There was no significant difference in blastocyst rate between group A and group B (P0.01) between), B group and C group (P0.05). The results showed that cumulus cells had an effect on the development of oocytes in vitro fertilized eggs. (4) the microinjection of intracytoplasmic sperm into porcine oocytes to prepare embryos was carried out and some improvements were made. Six fertilized blastocysts were successfully prepared, which laid a foundation for the preparation of transgenic pigs. Conclusion: cumulus cells can promote the maturation of oocytes in vitro and embryo development. It is better to select the cumulus-oocyte complex with more than three layers of density. Six fertilized oocysts were successfully prepared by single sperm microinjection of porcine embryos.
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828

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本文編號：2440697