【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)的主要病原體是豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),它主要引起仔豬的臨床病理特征是嘔吐、水樣腹瀉和脫水。各生長階段的豬均易感染PEDV,其中未斷奶仔豬的發(fā)病率高達100%,十日齡以內(nèi)的感染仔豬病死率為80%～100%。感染豬只雖然能夠存活,但是抵抗力下降,會導(dǎo)致其他相關(guān)疾病的混合感染。該病的爆發(fā)流行對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。PEDV的主要靶器官是仔豬小腸上皮,而在仔豬小腸上皮下廣泛的分布著大量的樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs),樹突狀細胞是目前已知的哺乳動物機體中功能最為強大的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC),它不僅在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過程中起到重要作用,同時還可以激活機體的抗病毒免疫應(yīng)答。本試驗以體外分離培養(yǎng)的豬單核源樹突狀細胞(Monocyte derived dendritic cells,Mo-DCs)和腸道樹突狀細胞為主要研究對象,通過體外試驗和體內(nèi)試驗驗證PEDV弱毒株CV777及其滅活毒與仔豬樹突狀細胞的相互作用,以此來探討PEDV弱毒株CV777及其滅活毒對仔豬樹突狀細胞主要免疫功能的影響,為研究PED的發(fā)病機制以及PEDV疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。1豬單核源DCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定DCs作為哺乳動物體內(nèi)功能最為強大的抗原遞呈細胞,是唯一能夠激活初始T細胞的一類異質(zhì)性細胞。它對于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、連接先天性免疫和獲得性免疫起到重要的紐帶作用。但是,DCs在機體中的含量是極少的,這對于DCs的研究十分不利。所以建立一套成熟的體外分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng)豬DCs的方法模型就顯得十分重要。由于豬DCs沒有特異性的表面標(biāo)志,因此我們只能從分離得到細胞的細胞形態(tài)、相關(guān)表面分子的鑒定以及生物學(xué)活性三個方面綜合起來對分離培養(yǎng)出來的樹突狀細胞進行鑒定。結(jié)果顯示我們分離培養(yǎng)的細胞有典型的樹突狀細胞形態(tài),我們選取的表面分子:SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ 的表達量分別可以達到58.95%、72.31%和13.39%,未成熟Mo-DCs經(jīng)LPS刺激24 h后可分化發(fā)育為成熟Mo-DCs,成熟 Mo-DCs 的 SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+的表達量可以達到66.17%、81.16%和34.30%。同時在吞噬試驗中未成熟、成熟DCs的結(jié)果也符合DCs的相關(guān)生物學(xué)特性,這些結(jié)果均表明本試驗分離培養(yǎng)到了高純度的豬單核源DCs,可以進行下一步的試驗研究。2豬流行性腹瀉病毒及其滅活毒對體外培養(yǎng)的豬單核源樹突狀細胞免疫功能的影響PEDV的主要靶組織是仔豬小腸上皮,而在仔豬小腸上皮下廣泛地分布著大量的DCs,DCs不僅在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過程中起到重要作用,同時還可以激活機體的抗病毒免疫應(yīng)答。為了探究PEDV及其滅活毒對豬DCs免疫功能的影響,我們用分離培養(yǎng)的仔豬單核源樹突狀細胞(Mo-DCs)與PEDV及其滅活毒共同作用,首先通過熒光定量和病毒滴度檢測PEDV對Mo-DCs細胞是否感染,再用流式細胞術(shù)和ELISA檢測PEDV及其滅活毒對選取的相關(guān)Mo-DCs細胞表面分子的表達量和細胞因子分泌量的影響,最后通過混合T淋巴反應(yīng)試驗驗證Mo-DCs在PEDV及其滅活毒的作用下對T細胞增殖能力的影響。結(jié)果表明,PEDV可以低水平感染未成熟、成熟Mo-DCs,并且未成熟Mo-DCs的易感性要高于成熟Mo-DCs;與對照組相比,PEDV及其滅活毒可以顯著的增加未成熟、成熟Mo-DCs表面分子CD1a~+、CD80/86~+和SLA-Ⅱ-DR~+表達量(P0.05);PEDV及其滅活毒可以使未成熟、成熟Mo-DCs分泌IL-12和IFN-γ顯著高于對照組(P0.05);未成熟、成熟Mo-DCs在PEDV及其滅活毒的作用下能顯著的刺激T細胞增殖(P0.05)。這些結(jié)果說明PEDV及其滅活毒可以顯著提高Mo-DCs的抗原遞呈、IL-12和IFN-γ的分泌以及刺激T細胞增殖的能力。3豬流行性腹瀉病毒弱毒株及其滅活毒對仔豬腸道樹突狀細胞免疫功能的影響為了進一步驗證PEDV及其滅活毒對仔豬DCs免疫功能的影響,我們通過體內(nèi)試驗對體外試驗得到的結(jié)果進一步驗證。本試驗首先給仔豬進行腸結(jié)扎手術(shù),向結(jié)扎腸段中注射PEDV及其滅活毒,通過免疫熒光和免疫組化的方法檢測不同時間點仔豬小腸絨毛和固有層 SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T細胞的數(shù)量變化,從而驗證腸道DCs在PEDV及其滅活毒作用后免疫功能的變化情況。結(jié)果顯示:注射PEDV 3 h后,仔豬腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs數(shù)目顯著增加(P0.05)。48 h之后,仔豬腸道絨毛上SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs 和 CD11b~+CD16~+DCs數(shù)目顯著增加(P0.05)。這說明在仔豬受到PEDV感染早期,腸道中的SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ DCs和CD11b~+CD16~+ DCs會迅速經(jīng)固有層向腸系膜淋巴結(jié)遷移,并且在持續(xù)感染中,機體通過增加小腸絨毛DCs來增強遞呈抗原能力。而給仔豬注射PEDV及其滅活毒15 min、3 h和48 h時間點,小腸絨毛、腸道固有層中的CD3~+、CD4~+和CD8~+T細胞相比對照組均呈現(xiàn)出顯著增加(P0.05)。這說明PEDV及其滅活毒可以通過增加腸道DCs遞呈功能而顯著刺激CD3~+、CD4~+和CD8~+ T細胞的增殖能力。為了進一步研究PEDV及其滅活毒對腸道DCs抗原遞呈功能的影響,本試驗給仔豬免疫PEDV及其滅活毒48 h后,用腸結(jié)扎手術(shù)向仔豬結(jié)扎腸段注射模式抗原-滅活大腸桿菌K88,用免疫熒光和免疫組化的方法檢測仔豬小腸絨毛和腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T 細胞的數(shù)目變化。結(jié)果表明,注射滅活K88 3 h后,各組仔豬腸道絨毛內(nèi)SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs的數(shù)量減少,而各處理組的仔豬腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+ DCs數(shù)量顯著增加(P0.05),這說明仔豬小腸絨毛中的DCs可能已經(jīng)向腸道固有層中進行遷移。而仔豬經(jīng)PEDV及其滅活毒免疫48 h后再注射滅活K88 15 min和3 h,各處理組中仔豬小腸絨毛和固有層內(nèi)CD3~+、CD4~+和CD8~+T細胞的數(shù)量均呈現(xiàn)顯著增加(P0.05)。以上結(jié)果說明腸道樹突狀細胞在PEDV弱毒株CV777及其滅活毒的作用下,其抗原遞呈和刺激T細胞增殖等免疫功能得到增強,這為研究PEDV的致病機制以及疫苗的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

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本文編號：2437887