【摘要】：豬肝羧酸酯酶(pig liver esterase,PLE),屬于絲氨酸水解酶,是由多種同工酶組成的酶家族,各同工酶之間基因序列高度同源。由于在催化底物水解時具有高度的立體選擇性和高度酶活性,PLE成為有機化學合成領域水解酶的主角,而PLE作為藥物代謝酶角色的研究很少。本課題組前期研究結(jié)果提示:PLE主要成員之一PLE1可催化水解某些磺胺類藥物,PLE同工酶活性存在差異,不同品種豬PLE同工酶豐度存在差異。受PLE表現(xiàn)出的高度水解活性、以及人羧酸酯酶的表達水平呈顯著年齡相關性且已成為臨床用藥依據(jù)事實的啟發(fā),同時基于本課題的前期研究,系統(tǒng)比較研究不同品種和不同年齡豬PLE同工酶豐度和總表達量差異,可望為豬臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)。本研究選取國家重點保護品種通城豬和外來優(yōu)良瘦肉型品種大白豬,進行PLE的品種差異研究;參考研究人羧酸酯酶表達譜的年齡段,選取8日、1月、3月、成年(6~7月)四個年齡段豬,每個年齡段選取3頭三代以內(nèi)無血緣關系的豬進行PLE表達譜研究。由于PLE同工酶之間的基因和氨基酸序列高度同源,導致RT-q PCR和WB無法區(qū)分各自的m RNA和蛋白質(zhì),因此,本研究先根據(jù)同工酶保守區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列,分別設計RT-q PCR通用引物和制備通用抗體,檢測PLE同工酶的m RNA和蛋白質(zhì)總表達水平,同時用通用底物p-NPA測定肝臟S9的水解活性;再通過對肝臟中PLE同工酶ORF的大量克隆、測序,獲得各同工酶出現(xiàn)的頻率。結(jié)合PLE同工酶的m RNA水平和各同工酶出現(xiàn)的頻率,得到各PLE同工酶表達豐度的數(shù)據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:對1月齡和成年的兩個品種豬,首先用RT-q PCR檢測了11種組織中(分別是肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、小腸、皮膚、肌肉、腦、淋巴結(jié)及胸腺)PLE同工酶m RNA總表達水平,結(jié)果表明無論年齡大小,PLE在兩種豬肝臟中表達量均為最高,其次為腎臟、小腸和皮膚。肝臟是機體內(nèi)主要的代謝解毒器官,同時PLE在肝臟中表達量也最高,因此,后續(xù)研究集中在豬肝臟中PLE上。RT-q PCR檢測四個年齡段的兩個品種豬肝臟中PLE同工酶m RNA總表達量。結(jié)果表明在通城豬和大白豬肝臟中PLE m RNA總表達量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡,但總體上m RNA表達水平與年齡呈正相關。兩個品種豬相比,除3月齡時通城豬的PLE m RNA表達水平比大白豬高,其它三個年齡段都是大白豬比通城豬的高。根據(jù)PLE同工酶靠近C末端的氨基酸保守序列設計合成兩種多肽段,即PLE-C1-1:SKEAAKKPPKIKC和PLE-C2:CNTQAAKRLKGEE,兩種多肽鏈等量混合后與KLH偶聯(lián),合成人工免疫原,免疫新西蘭大耳兔,獲得免疫血清,免疫血清用已偶聯(lián)前述兩種多肽的Sulfo Link凝膠柱進行免疫親和層析純化,得到效價高、特異性強的抗PLE通用抗體。等量混合同年齡段S9配制S9樣品,WB檢測S9樣品中PLE總蛋白量,用Image J讀取PLE和內(nèi)參GAPDH的灰度值,計算兩者的比值,得到四個年齡段通城豬和大白豬的比值依次是0.74,2.00,3.62,3.09和1.30,3.86,2.89,3.82,表明通城豬和大白豬PLE總蛋白表達量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡,但總體上PLE蛋白表達水平與年齡呈正相關。兩個品種豬相比,除3月齡時通城豬蛋白表達水平比大白豬高,其它的三個年齡段都是大白豬比通城豬高。PLE蛋白表達趨勢與m RNA一致。在含1μmol/L p-NPA的PBS(50m M,p H7.2)反應體系中,檢測肝臟S9樣品的催化水解活性,測得四個年齡段通城豬和大白豬的S9樣品比活依次是:0.19U,0.59U,0.9U,1.29U和0.4U,1.05U,1.22U,1.69U。PLE酶活性表現(xiàn)出隨年齡增長而增強的趨勢,與PLE的m RNA、蛋白質(zhì)的表達趨勢大體一致。兩個品種豬相比,四個年齡段大白豬的肝臟S9對p-NPA的水解活性都比通城豬強。通過以上試驗獲得了PLE同工酶的總表達量,但無法獲得同工酶各自表達豐度的數(shù)據(jù)�？寺∶款^豬肝臟中PLE同工酶各亞型的完整ORF。每頭豬隨機挑取至少20個陽性克隆進行測序,共測序800多個陽性克隆。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)共克隆到108種PLE亞型,除去5種已報道的亞型,發(fā)現(xiàn)103種新亞型,重復出現(xiàn)的PLE亞型有50多種,在2頭豬以上出現(xiàn)的有39種,其中有19種在兩個品種的豬中出現(xiàn)。將出現(xiàn)頻率高的54種亞型,按25個變異位點的氨基酸的相似度分為7大類(A~G),每一大類再用阿拉伯數(shù)字區(qū)分。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)兩個品種豬肝臟中PLE同工酶表達豐度存在明顯差異,大白豬的四個年齡段都是PLE-A1表達豐度最高,其次是PLE-B9;相反地,通城豬在前三個年齡段都是PLE-B9表達豐度最高,其次是PLE-A1(8日)或PLE-G5(1月和3月),而成年階段是PLE-G3表達豐度最高。還發(fā)現(xiàn)PLE-G5和PLE-G3分別在兩個品種豬的1月齡和成年期表達量大幅上升,提示PLE-G3和PLE-G5可能在兩個品種豬的生長和成年階段發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬肝臟中PLE存在顯著的品種差異,且其表達水平與年齡顯著相關,這將導致相同獸藥對不同年齡段和不同品種豬的療效和毒副作用差異,因此,豬相關獸藥的使用應根據(jù)豬的品種和年齡作出相應的調(diào)整。本研究獲得的數(shù)據(jù)、以及利用本研究獲得的大量PLE新亞進行水解獸藥特性的后續(xù)研究結(jié)果,可為豬的臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)。
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【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 徐三平;唐中林;杜亞球;劉榜;徐圣海;樊斌;李奎;;通城豬的生長、胴體及肉質(zhì)性狀相關分析[J];中國畜牧雜志;2006年03期

相關碩士學位論文 前2條

1 肖犟;PRRSV對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和免疫力相關指標的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

2 閆慧平;豬肝羧酸酯酶1水解磺胺類藥物的特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

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本文編號：2429224