【摘要】：豬肝羧酸酯酶(pig liver esterase,PLE),屬于絲氨酸水解酶,是由多種同工酶組成的酶家族,各同工酶之間基因序列高度同源。由于在催化底物水解時(shí)具有高度的立體選擇性和高度酶活性,PLE成為有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域水解酶的主角,而PLE作為藥物代謝酶角色的研究很少。本課題組前期研究結(jié)果提示:PLE主要成員之一PLE1可催化水解某些磺胺類藥物,PLE同工酶活性存在差異,不同品種豬PLE同工酶豐度存在差異。受PLE表現(xiàn)出的高度水解活性、以及人羧酸酯酶的表達(dá)水平呈顯著年齡相關(guān)性且已成為臨床用藥依據(jù)事實(shí)的啟發(fā),同時(shí)基于本課題的前期研究,系統(tǒng)比較研究不同品種和不同年齡豬PLE同工酶豐度和總表達(dá)量差異,可望為豬臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)。本研究選取國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)品種通城豬和外來優(yōu)良瘦肉型品種大白豬,進(jìn)行PLE的品種差異研究;參考研究人羧酸酯酶表達(dá)譜的年齡段,選取8日、1月、3月、成年(6~7月)四個(gè)年齡段豬,每個(gè)年齡段選取3頭三代以內(nèi)無血緣關(guān)系的豬進(jìn)行PLE表達(dá)譜研究。由于PLE同工酶之間的基因和氨基酸序列高度同源,導(dǎo)致RT-q PCR和WB無法區(qū)分各自的m RNA和蛋白質(zhì),因此,本研究先根據(jù)同工酶保守區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列,分別設(shè)計(jì)RT-q PCR通用引物和制備通用抗體,檢測(cè)PLE同工酶的m RNA和蛋白質(zhì)總表達(dá)水平,同時(shí)用通用底物p-NPA測(cè)定肝臟S9的水解活性;再通過對(duì)肝臟中PLE同工酶ORF的大量克隆、測(cè)序,獲得各同工酶出現(xiàn)的頻率。結(jié)合PLE同工酶的m RNA水平和各同工酶出現(xiàn)的頻率,得到各PLE同工酶表達(dá)豐度的數(shù)據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:對(duì)1月齡和成年的兩個(gè)品種豬,首先用RT-q PCR檢測(cè)了11種組織中(分別是肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、小腸、皮膚、肌肉、腦、淋巴結(jié)及胸腺)PLE同工酶m RNA總表達(dá)水平,結(jié)果表明無論年齡大小,PLE在兩種豬肝臟中表達(dá)量均為最高,其次為腎臟、小腸和皮膚。肝臟是機(jī)體內(nèi)主要的代謝解毒器官,同時(shí)PLE在肝臟中表達(dá)量也最高,因此,后續(xù)研究集中在豬肝臟中PLE上。RT-q PCR檢測(cè)四個(gè)年齡段的兩個(gè)品種豬肝臟中PLE同工酶m RNA總表達(dá)量。結(jié)果表明在通城豬和大白豬肝臟中PLE m RNA總表達(dá)量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡,但總體上m RNA表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)。兩個(gè)品種豬相比,除3月齡時(shí)通城豬的PLE m RNA表達(dá)水平比大白豬高,其它三個(gè)年齡段都是大白豬比通城豬的高。根據(jù)PLE同工酶靠近C末端的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)合成兩種多肽段,即PLE-C1-1:SKEAAKKPPKIKC和PLE-C2:CNTQAAKRLKGEE,兩種多肽鏈等量混合后與KLH偶聯(lián),合成人工免疫原,免疫新西蘭大耳兔,獲得免疫血清,免疫血清用已偶聯(lián)前述兩種多肽的Sulfo Link凝膠柱進(jìn)行免疫親和層析純化,得到效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗PLE通用抗體。等量混合同年齡段S9配制S9樣品,WB檢測(cè)S9樣品中PLE總蛋白量,用Image J讀取PLE和內(nèi)參GAPDH的灰度值,計(jì)算兩者的比值,得到四個(gè)年齡段通城豬和大白豬的比值依次是0.74,2.00,3.62,3.09和1.30,3.86,2.89,3.82,表明通城豬和大白豬PLE總蛋白表達(dá)量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡,但總體上PLE蛋白表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)。兩個(gè)品種豬相比,除3月齡時(shí)通城豬蛋白表達(dá)水平比大白豬高,其它的三個(gè)年齡段都是大白豬比通城豬高。PLE蛋白表達(dá)趨勢(shì)與m RNA一致。在含1μmol/L p-NPA的PBS(50m M,p H7.2)反應(yīng)體系中,檢測(cè)肝臟S9樣品的催化水解活性,測(cè)得四個(gè)年齡段通城豬和大白豬的S9樣品比活依次是:0.19U,0.59U,0.9U,1.29U和0.4U,1.05U,1.22U,1.69U。PLE酶活性表現(xiàn)出隨年齡增長(zhǎng)而增強(qiáng)的趨勢(shì),與PLE的m RNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢(shì)大體一致。兩個(gè)品種豬相比,四個(gè)年齡段大白豬的肝臟S9對(duì)p-NPA的水解活性都比通城豬強(qiáng)。通過以上試驗(yàn)獲得了PLE同工酶的總表達(dá)量,但無法獲得同工酶各自表達(dá)豐度的數(shù)據(jù)。克隆每頭豬肝臟中PLE同工酶各亞型的完整ORF。每頭豬隨機(jī)挑取至少20個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,共測(cè)序800多個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)共克隆到108種PLE亞型,除去5種已報(bào)道的亞型,發(fā)現(xiàn)103種新亞型,重復(fù)出現(xiàn)的PLE亞型有50多種,在2頭豬以上出現(xiàn)的有39種,其中有19種在兩個(gè)品種的豬中出現(xiàn)。將出現(xiàn)頻率高的54種亞型,按25個(gè)變異位點(diǎn)的氨基酸的相似度分為7大類(A~G),每一大類再用阿拉伯?dāng)?shù)字區(qū)分。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種豬肝臟中PLE同工酶表達(dá)豐度存在明顯差異,大白豬的四個(gè)年齡段都是PLE-A1表達(dá)豐度最高,其次是PLE-B9;相反地,通城豬在前三個(gè)年齡段都是PLE-B9表達(dá)豐度最高,其次是PLE-A1(8日)或PLE-G5(1月和3月),而成年階段是PLE-G3表達(dá)豐度最高。還發(fā)現(xiàn)PLE-G5和PLE-G3分別在兩個(gè)品種豬的1月齡和成年期表達(dá)量大幅上升,提示PLE-G3和PLE-G5可能在兩個(gè)品種豬的生長(zhǎng)和成年階段發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬肝臟中PLE存在顯著的品種差異,且其表達(dá)水平與年齡顯著相關(guān),這將導(dǎo)致相同獸藥對(duì)不同年齡段和不同品種豬的療效和毒副作用差異,因此,豬相關(guān)獸藥的使用應(yīng)根據(jù)豬的品種和年齡作出相應(yīng)的調(diào)整。本研究獲得的數(shù)據(jù)、以及利用本研究獲得的大量PLE新亞進(jìn)行水解獸藥特性的后續(xù)研究結(jié)果,可為豬的臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐三平;唐中林;杜亞球;劉榜;徐圣海;樊斌;李奎;;通城豬的生長(zhǎng)、胴體及肉質(zhì)性狀相關(guān)分析[J];中國(guó)畜牧雜志;2006年03期

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1 肖犟;PRRSV對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和免疫力相關(guān)指標(biāo)的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 閆慧平;豬肝羧酸酯酶1水解磺胺類藥物的特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2429224