【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種與蛋白質(zhì)加工和鈣離子儲存密切相關(guān)的重要細胞器,一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,或者發(fā)生未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白的累積,都會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進而通過未折疊蛋白反應(yīng)通路提高細胞對傷害的抵抗力和適應(yīng)力。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78,GRP78)又被稱為BiP/HSPA5是有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中央調(diào)節(jié)器,它的變化被普遍當(dāng)做內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激標(biāo)記,同時也是未折疊蛋白反應(yīng)的起始反應(yīng)。根據(jù)NCBI中提供的山羊GRP78基因序列,本試驗通過慢病毒載體pCD513B構(gòu)建了包含GRP78的全長cDNA的過表達載體,并用慢病毒干擾載體pCD513B-U6針對GRP78基因構(gòu)建了shRNA干擾序列以及用于干擾對照的包含同長度無意義序列片段的干擾載體。把穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染HEK293細胞,包裝并生產(chǎn)對應(yīng)的慢病毒。穩(wěn)定的克隆體系通�？梢陨a(chǎn)每毫升107轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(107 IU/mL)的病毒上清液。將慢病毒感染山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞(EEC)。通過RT-PCR和western blotting方法來檢測Grp78的表達情況。試驗結(jié)果如下:1.通過軟件對Grp78基因進行序列分析,得出Grp78的CDS區(qū)共編碼655個氨基酸,其相對分子質(zhì)量為72397.0 u,理論等電點PI為5.07。2.構(gòu)建了重組慢病毒過表達載體質(zhì)粒pCD513B-Grp78。將其酶切鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得8100 bp和2300 bp大小的兩個特異性片段,表明重組載體構(gòu)建成功。3.以Grp78基因的ORF區(qū)作為shRNA的靶基因,設(shè)計并合成4對具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸序列,經(jīng)由退火得到互補的雙鏈,然后克隆到慢病毒載體質(zhì)粒pCD513B-U6上,構(gòu)建Grp78基因重組慢病毒干擾載體并將其命名為pCD513B-U6-shRNA-Grp78。通過設(shè)計引物對pCD513B-U6-shRNA-Grp78載體進行PCR擴增鑒定,瓊脂糖凝膠電泳實驗得到350 bp大小的片段證明Grp78慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。4.將包裝質(zhì)粒和經(jīng)鑒定正確的重組慢病毒載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK 293細胞,生產(chǎn)慢病毒。5.將得到的Grp78過表達和干擾病毒感染山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞,結(jié)果證明過表達病毒使該細胞Grp78蛋白表達水平明顯升高,干擾病毒則能夠在mRNA水平上顯著抑制其表達,干擾效率在70%左右。針對山羊Grp78過表達和shRNA重組慢病毒載體制備成功,為進一步研究Grp78的生理功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Endoplasmic reticulum (ER) is an important organelle closely related to protein processing and calcium storage. Once there is a calcium homeostasis in the endoplasmic reticulum or the accumulation of unfolded proteins and misfolded proteins, endoplasmic reticulum stress will be induced. Furthermore, unfolded protein response pathway was used to enhance the resistance and adaptability of cells to injury. Glucose-regulated protein 78 (Glucose-regulated protein78,GRP78), also known as BiP/HSPA5, is the central regulator of endoplasmic reticulum function. Its changes are generally regarded as stress markers of endoplasmic reticulum and the initial reaction of unfolded protein. According to the goat GRP78 gene sequence provided in NCBI, a full-length cDNA expression vector containing GRP78 was constructed by lentivirus vector pCD513B. Lentivirus interference vector pCD513B-U6 was used to construct the shRNA interference sequence for GRP78 gene and the interference vector containing meaningless sequence fragments of the same length for interference control. Shuttle plasmids and packaging plasmids were transfected into HEK293 cells to package and produce the corresponding lentivirus. A stable clone system can normally produce viral supernatants per milliliter of 107 transduction units (107 IU/mL). Infection of goat endometrial epithelial cell (EEC). With lentivirus The expression of Grp78 was detected by RT-PCR and western blotting. The results are as follows: 1. The sequence analysis of Grp78 gene showed that the CDS region of Grp78 encodes 655 amino acids with a relative molecular weight of 72397.0 uand a theoretical isoelectric point PI of 5.07.2. The recombinant lentivirus overexpression vector pCD513B-Grp78. was constructed. Two specific fragments of 8100 bp and 2300 bp were obtained by agarose gel electrophoresis, indicating that the recombinant vector was successfully constructed. Using the ORF region of Grp78 gene as the target gene of shRNA, four pairs of oligonucleotide sequences with short hairpin structure were designed and synthesized. After annealing, complementary double strands were obtained and cloned into lentivirus vector pCD513B-U6. Construction of Grp78 Gene Recombinant Lentivirus interference Vector and its name pCD513B-U6-shRNA-Grp78. The pCD513B-U6-shRNA-Grp78 vector was amplified by PCR with designed primers. The agarose gel electrophoresis showed that the Grp78 lentivirus interference vector was successfully constructed by agarose gel electrophoresis with the size of 350 bp. The packaging plasmid and the identified recombinant lentivirus vector plasmid were co-transfected into HEK 293 cells to produce lentivirus. The overexpression of Grp78 and interference virus infection of goat endometrial epithelial cells showed that the overexpression of Grp78 protein was significantly increased by the overexpression virus, and the interference virus could significantly inhibit the expression of Grp78 protein at the mRNA level. The interference efficiency is about 70%. The over expression of goat Grp78 and the preparation of shRNA recombinant lentivirus vector were successful, which laid a foundation for further study on the physiological function of Grp78.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S827

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本文編號：2417446