【摘要】：牛副結(jié)核病又稱副結(jié)核性腸炎是以反芻動物為主同時也是人畜共患病,是由副結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium avium subsp Paratuberculosis,MAP)引起長期的、慢性的、頑固性的、消耗性的一種傳染病。1891年由Johne率先發(fā)現(xiàn)并且描述該病,所以我們把該病又稱約內(nèi)氏病(Johne’s disease),OIE將其列為B類疫病,該病能引起動物增生性腸炎,即將MP熱滅活或致弱后制成疫苗,然后免疫接種牛還有羊,可以降低病牛早期出現(xiàn)間接性腹瀉,能導(dǎo)致病畜產(chǎn)生頑固性腹瀉,潛伏期數(shù)月至一兩年。糞便非常的稀薄,并伴有惡臭的氣味,腹瀉常呈噴射狀態(tài)排出,糞便帶有氣泡和黏液,最終導(dǎo)致的結(jié)果是死亡。還可以通過有病的牛羊傳染給人以及其他動物,本病能在全球范圍內(nèi)非常廣泛的流行,目前并沒有有效的治療辦法,只能做到預(yù)防為主,可以從疫病的傳播途徑做到預(yù)防,并且日常的飼養(yǎng)管理需要提高,來增加動物的自身抵抗力。最主要是對牛群做徹底的檢疫工作,用PPD檢測法,對檢測出的病牛做第二次檢測,一旦確定患病一定要進行隔離并做出適當(dāng)?shù)奶蕴筒稓�。有的國家為了控制副結(jié)核病的傳播與蔓延,會給牛群做疫苗的接種,來減少此病的發(fā)生,這種方法也是存在很大的弊端,影響血清學(xué)檢測和變態(tài)反應(yīng)檢測,接種疫苗后會使健康的無病的動物血清轉(zhuǎn)為陽性,同時在疫苗的注射部位會有肉芽腫的產(chǎn)生,這樣就會影響牛副結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果。因為接種疫苗后影響了對牛的正常檢疫工作,所以,有很多國家已經(jīng)規(guī)定不允許給牲畜接種疫苗,怕妨礙牲畜的進出口貿(mào)易。副結(jié)核病被認(rèn)為是給養(yǎng)牛行業(yè)帶來經(jīng)濟的損失最最重要的因素,尤其是對養(yǎng)牛行業(yè)和奶制品行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,可見,迫切需要開發(fā)新型、安全、高效抗副結(jié)核分枝桿菌的疫苗以及特異性非常良好的診斷抗原試劑已經(jīng)迫在眉睫。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得副結(jié)核分枝桿菌34kD抗原,用該菌株表達(dá)的34kD蛋白作為牛副結(jié)核病診斷抗原或者是亞單位疫苗。以副結(jié)核染色體DNA基因組為模板,以特異性引物對其進行PCR擴增,以凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物,進而克隆至JM109中,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-34。通過藍(lán)白斑、質(zhì)粒大小、酶切分析及PCR篩選、鑒定重組質(zhì)粒,并進行序列分析。重組質(zhì)粒pMD-18T-34及表達(dá)載體pET28a均以BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切,切膠回收純化后,以T4 DNA Lingase于16℃連接2 h,4℃過夜,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-34,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α中,篩選、鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,用SDS-PAGE和Western blotting檢測目的基因在E.coli BL-21中的表達(dá)。將獲得純化后的34kD基因,對牛場采集的血液進行牛的副結(jié)核病檢測,首先要確定抗原的包被濃度和血清的最佳稀釋倍數(shù),通過間接ELISA實驗的方法測得的OD492之P/N比值,P/N比值最大者為11.888,即重組蛋白的最適包被濃度為0.6μg/mL,血清樣本的最佳稀釋倍數(shù)為1∶400進行檢測,用34kD抗原對比對359份牛血清進行檢測,PPD檢出陽性血清28份,抗原34kD檢出陽性血清23份,34kD檢出陰性血清326份,PPD檢出陰性血清321份,其中陽性的符合率為82.14%。陰性的符合率為98.46%,因此本課題的研究成果不僅在副結(jié)核病的診斷方面具有重要的應(yīng)用價值,而且對開發(fā)副結(jié)核病新型的疫苗具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.618

【參考文獻】

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2 陳茹;劉中勇;高小博;劉志玲;吳曉薇;曾碧健;羅長保;林志雄;;副結(jié)核熒光PCR試劑盒研制與應(yīng)用[J];微生物學(xué)通報;2009年02期

3 王春雨;楊莉;劉金華;宋占昀;周亮;王海軍;王振國;王全凱;;應(yīng)用TaqMan熒光定量PCR快速檢測鹿血中副結(jié)核分枝桿菌[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2011年03期

4 曾凡利;胡玉慶;徐鳳宇;王春芳;姜秀云;;副結(jié)核分枝桿菌SOD基因的克隆與序列分析[J];中國獸藥雜志;2008年03期

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本文編號：2378170