【摘要】：精子發(fā)生(spermatogenesis)包含了生物體內(nèi)一個(gè)經(jīng)典的干細(xì)胞系統(tǒng),也是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控過程,它包括了體細(xì)胞發(fā)育的抑制、細(xì)胞多能性的啟動(dòng)和全基因組表觀遺傳水平的重編程三個(gè)復(fù)雜的生物過程。在生物個(gè)體整個(gè)生殖過程中,通過雄性生殖干細(xì)胞(male germ line stem cells, mGSCs)這個(gè)特定的細(xì)胞群體,能夠持續(xù)不斷的產(chǎn)生高度分化的精子。雄性GSCs是一類單性能的細(xì)胞,在生物體內(nèi)只供維持精子生成。因而,一般將mGSCs視為是生物體性別分化之后,精子發(fā)生的最初細(xì)胞形態(tài)；而原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)的產(chǎn)生,遷移和定位視為mnGSCs的起源。目前,研究者們通過分離培養(yǎng),體外誘導(dǎo),構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等多種方式對(duì)原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells, PGCs)以及精原干細(xì)胞(Spermatogonial Stem cells, SSCs)的生長(zhǎng)和分化進(jìn)行了研究,但關(guān)于調(diào)控雄性生殖細(xì)胞發(fā)生這一過程的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)知之甚少,有關(guān)生殖細(xì)胞發(fā)生和分化機(jī)制的研究成為近年來備受關(guān)注的焦點(diǎn)。雄性生殖細(xì)胞的分化過程受到許多內(nèi)源性調(diào)控因子的調(diào)控,另外還會(huì)受到許多細(xì)胞外基質(zhì)等外源因素的影響。而這些因子是通過不同的信號(hào)通路進(jìn)行綜合調(diào)控,構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),能夠直接地或間接地調(diào)控雄性生殖細(xì)胞的形成。隨著現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)的全面發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)已成為研究全基因組基因表達(dá)規(guī)律的重要研究技術(shù)。通過本實(shí)驗(yàn)室前期完成的雞雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq測(cè)序結(jié)果,對(duì)雞雄性生殖細(xì)胞發(fā)生過程中的全基因組水平的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行綜合分析,將有助于全面系統(tǒng)地分析基因動(dòng)態(tài)表達(dá),查找參與調(diào)控的信號(hào)通路,并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為闡明生殖細(xì)胞的發(fā)生及分化機(jī)制提供有力的理論依據(jù)。通過對(duì)雞雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄本差異基因進(jìn)行的分析,實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路以及TGF-β信號(hào)通路參與雞雄性生殖細(xì)胞的形成過程。但是,由于雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生及分化是通過多通路以及多基因之間綜合調(diào)控的。因此,單從這兩個(gè)信號(hào)通路去構(gòu)建雞雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生及分化調(diào)控機(jī)制是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。為了進(jìn)一步研究調(diào)控雞雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生及分化機(jī)制,本研究對(duì)雞雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄本差異基因進(jìn)行了進(jìn)一步的深入分析,篩選出了另一條對(duì)雄性生殖細(xì)胞形成過程起到重要調(diào)控作用的JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription)信號(hào)通路,并對(duì)該通路進(jìn)行了體內(nèi)和體外的功能驗(yàn)證；為了解決體外雄性生殖細(xì)胞分化效率較低的問題,本研究還通過懸滴培養(yǎng)的方法,摸索雞ESCs形成類胚體的最佳條件；最后對(duì)不同的誘導(dǎo)體系進(jìn)行了比較,以期為ESCs向雄性生殖細(xì)胞定向分化篩選出最佳誘導(dǎo)體系,為生殖細(xì)胞形成機(jī)制的闡明提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：(1)本研究通過對(duì)雞ESCs-male、PGCs-male和SSCs轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果,從整體轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)雄性生殖細(xì)胞生成過程中基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,進(jìn)行系統(tǒng)、全面地分析。通過篩選差異表達(dá)基因,探討雞雄性生殖細(xì)胞形成過程中三種細(xì)胞的關(guān)鍵基因的表達(dá)變化,并利用GO分析和pathway分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,篩選參與調(diào)控雞雄性生殖細(xì)胞形成過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路。通過上述過程,本研究篩選出差異信號(hào)通路——JAK-STAT信號(hào)通路可能參與雞雄性生殖細(xì)胞形成過程。為了驗(yàn)證RNA-Seq分析結(jié)果的可靠性,通過qRT-PCR和Microarray測(cè)序技術(shù)雙向檢驗(yàn)了RNA-Seq測(cè)序結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示,所選基因的表達(dá)趨勢(shì)在qRT-PCR, Microarray和RNA-Seq三種結(jié)果中雖然表達(dá)差異倍數(shù)上有所不同,但是變化趨勢(shì)一致,驗(yàn)證了RNA-Seq測(cè)序結(jié)果的可靠性,說明基于RNA-Seq結(jié)果而篩選的參與雞雄性生殖細(xì)胞分化過程的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路具有可靠性和準(zhǔn)確性。(2)將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第三代,采用1×104個(gè)/mL,3R104個(gè)/mL和6×104個(gè)/mL三個(gè)細(xì)胞濃度,使用懸滴培養(yǎng)后觀察類胚體的形成效率。并通過形態(tài)學(xué),qRT-PCR,免疫細(xì)胞化學(xué),核型分析以及類胚體體外自分化等方法對(duì)形成的類胚體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,在3×104個(gè)/mL的細(xì)胞濃度下,通過不含干細(xì)胞維持因子的培養(yǎng)液懸滴培養(yǎng)48h,類胚體形成數(shù)量最多,單個(gè)視野下可觀察到約267個(gè)類胚體,表明3×104個(gè)/mL為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度。能一次性獲得相對(duì)較多的EB,且大小基本一致,可重復(fù)性高。對(duì)形成的類胚體進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其持續(xù)表達(dá)干性基因Nanog, Sox2, Oct4和C-kit,且免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Nanog和SSEA-1呈陽性。另外,對(duì)懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進(jìn)行核型分析,發(fā)現(xiàn)類胚體在形成過程中具有正常的核型。試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究中采用懸滴培養(yǎng)法形成類胚體能夠分化成3個(gè)胚層,可用于體外定向誘導(dǎo)過程。該研究建立了雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的培養(yǎng)體系,為后期信號(hào)通路的體外驗(yàn)證提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。(3)取培養(yǎng)至2代的雄性ESCs,利用反式維甲酸(ATRA, All Trans Retinoic Acid),維甲酸類似物(Am80,Tamibarotene)以及雌二醇(E2,Tamibarotene),探索體外誘導(dǎo)雞ESCs向雄性生殖細(xì)胞(MGCs)分化的效果。結(jié)果表明：ATRA誘導(dǎo)組,2-4d類胚體逐漸形成并增加,6-8d類胚體細(xì)胞發(fā)生解體,12d觀察到生殖樣細(xì)胞,成葡萄串狀聚團(tuán)生長(zhǎng)；生殖細(xì)胞相關(guān)基因Cvh,C-kit,integrina6和integrinβ1的最高表達(dá)量可分別達(dá)到1.03,0.52,0.86和1.50。Am80誘導(dǎo)組,4-6d類胚體出現(xiàn)并逐漸增大,8-10d類胚體解體變?yōu)樾〉膱A形細(xì)胞,12d觀察到生殖樣細(xì)胞；生殖細(xì)胞相關(guān)基因Cvh,C-kit,integrina6和integrinβ1的最高表達(dá)量可分別達(dá)到0.85,0.40,1.01和0.98。E2誘導(dǎo)組,2-4d類胚體出現(xiàn),6-8d持續(xù)形成并逐漸增大,10d部分類胚體開始解體,少量生殖樣細(xì)胞開始形成,12d觀察到生殖樣細(xì)胞數(shù)目增加,并呈現(xiàn)出聚團(tuán)生長(zhǎng)的趨勢(shì)；生殖細(xì)胞相關(guān)基因Cvh,C-kit, integrina6和integrinβ1的最高表達(dá)量可分別達(dá)到0.48,0.50,1.10和1.20。自分化組生殖細(xì)胞相關(guān)基因Cvh, C-kit, integrina6和integrinβ1的表達(dá)無明顯變化。結(jié)果證明,反式維甲酸(ATRA),維甲酸類似物(Am80)以及雌二醇(E2)可以作為雞ESCs體外定向誘導(dǎo)分化為雄性生殖細(xì)胞的候選誘導(dǎo)劑。該研究為進(jìn)一步優(yōu)化雞ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化的誘導(dǎo)體系,為進(jìn)一步深入研究JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。(4)取新鮮的受精雞胚,利用JAK-STAT信號(hào)通路抑制劑Cucurbitacin I和激動(dòng)劑IL6進(jìn)行雞胚注射,并設(shè)立正常孵化組和對(duì)照組,正常條件孵化。分別收集雞胚孵化4.5 d的生殖嵴樣本及19 d睪丸樣本,qRT-PCR,Western blot,細(xì)胞流式分選,PAS染色,免疫組化等方法檢測(cè)雞雄性生殖細(xì)胞體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化,以揭示JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)生殖細(xì)胞的分化作用。結(jié)果表明,JAK-STAT信號(hào)通路抑制后孵化4.5d的雞胚生殖嵴中,抑制組生殖細(xì)胞標(biāo)記基因Cvh的表達(dá)量(12.34)和C-kit的表達(dá)量(14.83)與對(duì)照組相比均顯著下調(diào)；孵化19d睪丸中,抑制組integrina6的表達(dá)量(30.03)和integrinβ1的表達(dá)量(36.48)與對(duì)照組相比顯著下降。與此同時(shí),流式分選檢測(cè)的生殖細(xì)胞Cvh,C-kit,integrina6和integrinfβ1標(biāo)記率分別下降至7.3%,12.8%,5.6%和5.3%。PAS染色和免疫組化染色結(jié)果表明,JAK-STAT信號(hào)通路被抑制后,4.5d雞胚的性腺發(fā)育遲緩,性腺內(nèi)PGCs數(shù)量減少。相反,JAK-STAT信號(hào)通路被激動(dòng)后,生殖細(xì)胞標(biāo)記基因Cvh和C-kit基因的表達(dá)量分別提高至15.82和16.13,流式分選檢測(cè)的生殖細(xì)胞Cvh和C-kit P日性細(xì)胞率分別上升至11-3%和14.1%。PAS染色和免疫組化染色結(jié)果表明,JAK-STAT信號(hào)通路被激動(dòng)后,4.5d雞胚性腺內(nèi)PGCs數(shù)量顯著提高。該結(jié)果驗(yàn)證了JAK-STAT信號(hào)通路在雞雄性生殖細(xì)胞體內(nèi)分化過程中起到關(guān)鍵作用。JAK-STAT信號(hào)通路參與雞雄性生殖細(xì)胞體內(nèi)分化過程,尤其是對(duì)雞雄性生殖細(xì)胞的早期形成具有重要調(diào)控作用。(5)取培養(yǎng)至2代的雄性ESCs,在RA誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上,加入抑制劑Cucurbitacin I和激動(dòng)劑IL6,對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路在雞ESCs體外定向分化為雄性生殖細(xì)胞過程的作用進(jìn)行了研究。qRT-PCR,細(xì)胞間接免疫熒光等方法檢測(cè)誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵基因和蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,以揭示JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)生殖細(xì)胞的體外分化過程的作用。結(jié)果表明,在RA能夠成功激活生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因C-kit, Cvh, integrina6和intergrinβ1的基礎(chǔ)上,加入JAK-STAT信號(hào)通路抑制劑后,C-kit最高表達(dá)量?jī)H為0.32,Cvh的最高表達(dá)量?jī)H達(dá)到0.41；細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)同樣顯示C-kit和Cvh陽性細(xì)胞數(shù)目少于RA誘導(dǎo)組,RA誘導(dǎo)組相比C-kit和Cvh激活受到了抑制；并且在誘導(dǎo)期間,抑制組integrina6和intergrinβ1的表達(dá)水平均低于同一時(shí)間RA誘導(dǎo)下的表達(dá)水平,RA的誘導(dǎo)效果受到了抑制作用。相反,加入JAK-STAT信號(hào)通路激動(dòng)劑后,誘導(dǎo)6d就出現(xiàn)了生殖細(xì)胞特異基因C-kit和Cvh的表達(dá)高峰,比RA誘導(dǎo)激活時(shí)間提前；并且integrina6和intergrinβ1的表達(dá)量分別能提高至1.60和1.65,細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)同樣顯示integrina6和intergrinβ1陽性細(xì)胞數(shù)目少于RA誘導(dǎo)組,JAK-STAT通路激動(dòng)劑IL6促進(jìn)了RA的誘導(dǎo)效果。該結(jié)果驗(yàn)證了JAK-STAT信號(hào)通路在雞ESCs向雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化過程中起到關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S831

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本文編號(hào)：2369900