【摘要】：雞產(chǎn)蛋下降綜合癥是由減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)引起的以產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量降低、蛋體畸形、蛋品品質(zhì)低劣等癥狀的傳染性疾病。目前,關(guān)于EDSV相關(guān)的研究文獻(xiàn)相對(duì)較少,大多集中于疾病診斷,血清抗體水平監(jiān)測(cè)以及對(duì)該病毒基因組的相關(guān)分析。因此,關(guān)于EDSV感染特性以及病毒進(jìn)入細(xì)胞的途徑還不是很清楚。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄縀DSV經(jīng)入宿主細(xì)胞的途徑,以及病毒對(duì)鴨胚成纖維(Duck embryonic fibroblast,DEF)細(xì)胞和雞胚肝(chick embryo liver,CEL)細(xì)胞的感染特性,從而為研究該病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染機(jī)制提供相關(guān)的理論依據(jù)及技術(shù)支持。1.根據(jù)GenBank上已發(fā)表的EDSV全基因序列(Y09598.1),設(shè)計(jì)合成了一對(duì)擴(kuò)增Penton基因的特異性引物,通過(guò)基因擴(kuò)增,載體構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的梯度稀釋,構(gòu)建了一條用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)EDSV的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,該方法具有敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可直接用于對(duì)EDSV病毒粒子的定量檢測(cè)。用EDSV感染原代DEF和CEL細(xì)胞,同時(shí)在感染后不同時(shí)間點(diǎn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)病毒的增殖情況。結(jié)果顯示,EDSV能夠引起DEF和CEL細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變,在感染后72 h,細(xì)胞病變最為明顯,且細(xì)胞上清液中病毒的滴度最高,病毒HA效價(jià)分別為212和211。此外,病毒增殖曲線顯示DEF細(xì)胞的病毒滴度在整個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上都要比CEL細(xì)胞的病毒滴度高。2.用EDSV感染DEF細(xì)胞后0 min,10 min,20 min,30 min,2 h,and 72 h,分別制備透射電子顯微鏡超薄切片并用4%乙酸雙氧鈾染色。結(jié)果表明,在感染后10 min,EDSV就能觸發(fā)DEF細(xì)胞膜內(nèi)陷,在20 min時(shí),即能夠形成完整的包裹病毒的Qg吞囊泡,隨后包裹病毒粒子的囊泡向細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)輸。在感染72 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)聚集大量的病毒粒子,且細(xì)胞發(fā)生破裂。3.用chlorpromazine(CPZ,特異性抑制clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞作用)、sucrose(高濃度的蔗糖能夠抑制clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞作用)、NH4Cl和MβCD(caveolin介導(dǎo)內(nèi)吞作用和脂質(zhì)筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用)處理DEF細(xì)胞后感染EDSV,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EDSV含量變化。結(jié)果顯示,CPZ和sucrose處理組能夠顯著降低病毒含量,并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,而MβCD處理組無(wú)顯著性差異。同時(shí),NH4Cl也能夠顯著降低病毒含量。4.為觀察抑制劑對(duì)EDSV進(jìn)入的影響,用CPZ(50μmol/L)和sucrose(100 mmol/L)在37°C條件下處理DEF細(xì)胞1 h,感染EDSV,未感染的DEF細(xì)胞作為陰性對(duì)照,感染EDSV的未處理的DEF細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。以制備的鼠抗EDSV高免血清作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光染色。結(jié)果表明,與對(duì)照相比,CPZ和sucrose處理的DEF細(xì)胞,熒光聚集在細(xì)胞周?chē)?成點(diǎn)狀分布,而陽(yáng)性對(duì)照則呈彌散狀分布于細(xì)胞內(nèi)部。所有結(jié)果表明EDSV能夠通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,且進(jìn)入細(xì)胞的途徑是clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,并且具有PH依賴(lài)性。
[Abstract]:Egg drop syndrome (EPS) is a kind of infectious disease caused by egg drop syndrome virus (Egg drop syndrome virus,EDSV), which is characterized by egg production reduction, egg body malformation and poor egg quality. At present, there are relatively few studies on EDSV, mostly focused on disease diagnosis, serum antibody level monitoring and the analysis of the genome of the virus. Therefore, the characteristics of EDSV infection and the way the virus enters cells are not well understood. The purpose of this study was to investigate the pathway of EDSV into host cells and the infection characteristics of the virus on duck embryo fibroblast (Duck embryonic fibroblast,DEF cells and chicken embryo liver (chick embryo liver,CEL cells. Therefore, it provides relevant theoretical basis and technical support for studying the infection mechanism of the virus on host cells. 1. According to the published EDSV gene sequence of GenBank (Y09598.1), a pair of specific primers for amplification of Penton gene were designed and synthesized. The primers were constructed by gene amplification, vector construction and gradient dilution of standard positive plasmid. A standard curve for real-time fluorescence quantitative PCR detection of EDSV was constructed. The results show that the method is sensitive and reproducible, and can be directly used for quantitative detection of EDSV virus particles. The primary DEF and CEL cells were infected with EDSV, and the virus proliferation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR at different time points after infection. The results showed that EDSV could induce cytopathic changes in DEF and CEL cells. The cytopathic effect was the most obvious at 72 h after infection, and the titer of virus in the supernatant was the highest. The titer of virus HA was 212 and 211respectively. In addition, the virus proliferation curve showed that the virus titer of DEF cells was higher than that of CEL cells. Transmission electron microscope (TEM) ultrathin sections were prepared at 0 min,10 min,20 min,30 min,2 and 72 h after DEF cells were infected with EDSV. The results showed that at 10 min,EDSV after infection, the DEF cell membrane trapping could be triggered. At 20 min, the complete Qg endocytosis vesicles could be formed, and then the vesicles encapsulated the virus particles were transported into the cells. After 72 h of infection, a large number of virus particles were accumulated in the cells and the cells ruptured. ), sucrose (high concentration sucrose can inhibit clathrin mediated endocytosis) NH4Cl and M 尾 CD (caveolin mediated endocytosis and lipid raft mediated endocytosis) treatment of DEF cells infected with EDSV, Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the change of EDSV content. The results showed that CPZ and sucrose could significantly decrease the virus content in a dose-dependent manner, but there was no significant difference in M 尾 CD treatment. At the same time, NH4Cl can also significantly reduce the virus content. In order to observe the effect of inhibitor on EDSV entry, DEF cells were treated with CPZ (50 渭 mol/L) and sucrose (100 mmol/L) at 37 擄C for 1 hour, and DEF cells infected with EDSV, were used as negative control. Untreated DEF cells infected with EDSV served as positive control. The prepared mouse anti-EDSV high-immune serum was used as the first antibody for indirect immunofluorescence staining. The results showed that the fluorescence of DEF cells treated with CPZ and sucrose gathered around the cells and distributed in dots, while the positive control cells distributed diffusely in the cells. All the results showed that EDSV could enter cells through endocytosis, and the pathway to enter cells was clathrin mediated endocytosis, which was PH dependent.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2366785