【摘要】：坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒(Tembusu virus)引起的,該病能導(dǎo)致蛋鴨的產(chǎn)蛋下降、生長(zhǎng)遲緩以及死亡,同時(shí)該病毒對(duì)肉鴨及蛋鴨都有致病力,鴨子感染后,臨床出現(xiàn)高熱、沉郁、厭食等癥狀;蛋鴨、種鴨的產(chǎn)蛋量開始下降而且下降比較迅速直到蛋鴨、種鴨不產(chǎn)蛋;肉鴨出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩。坦布蘇病毒病的發(fā)病率最高可以達(dá)100%,死亡率在5%-10%之間。坦布蘇病毒的E蛋白含有病毒的抗原決定簇,構(gòu)成坦布蘇病毒的主要抗原表為,而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主細(xì)胞的過程中都起著重要的作用。本研究用RT-PCR檢測(cè)方法來擴(kuò)增Tembusu的E基因,然后連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+),轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細(xì)胞能成功表達(dá)重組蛋白His-E。蛋白大小為54kDa,表達(dá)的產(chǎn)物以存在與沉淀中,具體是在包涵體中。Western blot結(jié)果表明目的蛋白可與坦布蘇病毒鴨的陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。利用包涵體粗純化的方法得到的高純度的重組蛋白,用紫外分光吸收法測(cè)定其濃度為2.978g/L。對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行乳化,乳化的方法是與弗氏佐劑等體積震蕩,然后每只BALB/c小鼠注射0.2mg重組蛋白的劑量,進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射,每隔兩周免疫一次,3免后,可加強(qiáng)免疫,眼眶取血,分離血清。以該血清作為一抗開展IFA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,坦布蘇病毒在感染BHK-21細(xì)胞36h后,用倒置熒光顯微鏡可以看到實(shí)驗(yàn)孔有特異性的綠色熒光,而對(duì)照組細(xì)胞無綠色熒光,表明表達(dá)純化的E蛋白具有良好的免疫原性。根據(jù)Tembusu virus E基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,對(duì)E基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將純化回收的產(chǎn)物連接到pMD19-T載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-19-E。然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定,將陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板建立SYBR-Green 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)做特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和重復(fù)性檢測(cè)。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后,建立的坦布蘇病毒的SYBR-Green 1熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系R2均在0.99以上,平均試驗(yàn)間變異系數(shù)為0.26%;檢測(cè)敏感性可達(dá)到2×10~1copies/μL。應(yīng)用該方法對(duì)人工感染坦布蘇病毒的麻鴨的腦、脾臟、肝臟、胰腺,進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè),結(jié)果從36份病料組織中檢出35份為陽(yáng)性,檢出率為97%,而常規(guī)PCR的檢出率為42%。結(jié)果表明,成功建立了檢測(cè)坦布蘇病毒的SYBR-Green 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),該方法較常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法更快捷,敏感,準(zhǔn)確,適用于坦布蘇病毒臨床樣品的檢測(cè)。
[Abstract]:Tambusuvirus disease is caused by Tambusuvirus (Tembusu virus), which can cause egg laying down, growth retardation and death in laying ducks, and the virus is virulent to both meat and laying ducks. When ducks are infected, they develop high fever and depression in clinic. Symptoms such as anorexia; Egg production begins to decline and declines rapidly until it does not lay eggs; the meat duck grows slowly. The highest incidence of Tabusu virus can be as high as 100 and the mortality rate is between 5-10%. The E protein of TBV contains the antigenic determinant of the virus, which is the main antigen of TBV, and plays an important role in the adsorption of the virus and the invasion of the host cells by the virus. In this study, the E gene of Tembusu was amplified by RT-PCR, then ligated into prokaryotic expression vector pET-32a (), and transformed into Escherichia coli BL21 cells to express the recombinant protein His-E. successfully. The protein was 54kDa.The expressed product existed and precipitated. The. Western blot results in the inclusion body showed that the target protein could react specifically with the positive serum of Tambusuvirus duck. The results showed that the expressed recombinant protein had good reactivity. The high purity recombinant protein was obtained by the method of crude purification of inclusion body. The concentration of the recombinant protein was 2.978 g / L by UV spectrophotometry. The purified target protein was emulsified by shaking with Freund's adjuvant in volume, then each BALB/c mouse was injected with the dose of 0.2mg recombinant protein. Can enhance immunity, orbital blood, separation of serum. The serum was used as the first antibody to carry out IFA test. The results showed that the specific green fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope after infection with BHK-21 cells for 36 hours, but no green fluorescence was found in the control cells. The results showed that the purified E protein had good immunogenicity. According to the sequence of Tembusu virus E gene, a pair of specific primers were designed by using Primer 5.0 software. The E gene was amplified by PCR. Then the purified and recovered product was ligated into pMD19-T vector to construct the recombinant plasmid pMD-19-E.. Then the recombinant plasmid was digested by PCR, and identified by sequencing. The positive plasmid was used as a template to establish the real-time fluorescence quantitative PCR curve of SYBR-Green 1. The specificity, sensitivity and repeatability were also detected. After optimizing the reaction conditions, the linear relationship R2 of the standard RT-PCR curves of SYBR-Green 1 fluorescence quantitative RT-PCR of Tambusuvirus were all above 0.99, the average coefficient of variation between tests was 0.26, and the detection sensitivity could reach 2 脳 10~1copies/ 渭 L. This method was used to detect the brain, spleen, liver and pancreas of duck infected with TBV by fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that 35 of 36 samples were positive and the detection rate was 97%. The positive rate of routine PCR was 42. The results showed that SYBR-Green _ 1 real-time quantitative PCR was successfully established for detection of Tambusuvirus. The method was more rapid, sensitive and accurate than the conventional RT-PCR detection method, and was suitable for clinical detection of Tambusuvirus.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2362368