【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)為格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)病原,定殖于豬上呼吸道,該菌可引發(fā)以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的系統(tǒng)性疾病。Dsb A為二硫鍵氧化還原酶,參與催化蛋白二硫鍵的折疊,通過影響蛋白的高級結(jié)構(gòu)而影響蛋白的活性和功能,細(xì)菌能編碼不同數(shù)量和不同類型的Dsb A同系物。副豬嗜血桿菌中存在兩個Dsb A,Dsb A1與E.coli K-12的Dsb A氨基酸一致性為47%,Dsb A2與Ec Dsb A不具有氨基酸相似性,兩者的功能尚未見任何文獻(xiàn)報道,其在副豬嗜血桿菌中的作用有待研究。本課題試圖構(gòu)建副豬嗜血桿菌SH0165菌株Δdsb A基因缺失株和互補菌株,通過生化特性分析和基因功能的初步研究探索Dsb A在副豬嗜血桿菌中所發(fā)揮的作用。具體過程如下:1、dsb A基因缺失株和互補菌株的構(gòu)建首先,以SH0165基因組為模板PCR擴(kuò)增dsb A1和dsb A2基因的上下游同源臂,并以p SHK3和p AT18質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增kan片段和erm片段,通過重疊PCR將同源臂與對應(yīng)的抗性片段重疊連接,分別克隆至自殺性質(zhì)粒p K18和穿梭質(zhì)粒p SHK3中,成功構(gòu)建了p K18-dsb A1-UKD、p K18-dsb A2-UED、p SHK3-dsb A1-UKD、p SHK3-dsb A2-UED重組質(zhì)粒,最終由自然轉(zhuǎn)化成功獲得Δdsb A1和Δdsb A2基因缺失株。其次,本課題將dsb A1編碼序列及其上游啟動子和下游終止子序列克隆至p SHK3穿梭載體構(gòu)建p SHK3-C-dsb A1質(zhì)粒,p SHK3-C-dsb A1經(jīng)體外甲基化后電轉(zhuǎn)入Δdsb A1中成功獲得互補菌株。2、Dsb A1和Dsb A2生化特性研究首先,測定SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2各菌株在不同Cu Cl2濃度(0~10m M)OD600的變化情況,在菌體內(nèi)檢測Dsb A1和Dsb A2的異構(gòu)酶活性。結(jié)果顯示SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2的OD600隨著銅離子濃度的增加不斷減小,但減小趨勢一致,即各菌株對銅的敏感程度一致。推測Dsb A1和Dsb A2均不是二硫鍵還原/異構(gòu)酶,不能異構(gòu)由銅造成的蛋白的錯誤折疊。其次,在p ET28a載體中構(gòu)建Dsb A1、Dsb A2和Trx A(陽性對照)原核表達(dá)重組質(zhì)粒,表達(dá)并純化,純化的蛋白用于胰島素還原實驗。結(jié)果顯示異構(gòu)酶Trx A(還原酶)、Dsb A1和Dsb A2均能催化DTT對胰島素的還原作用,Dsb A1和Dsb A2催化速率低于異構(gòu)酶Trx A,出現(xiàn)了20min的滯后。證實Dsb A1和Dsb A2不是二硫鍵異構(gòu)酶。最后,測定SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2菌株在1m M DTT濃度下的存活情況。結(jié)果顯示SH0165和Δdsb A2對DTT的敏感程度一致,而Δdsb A1顯著比SH0165和Δdsb A2對DTT更敏感。推測Dsb A1是二硫鍵氧化折疊酶能抵抗DTT的還原作用。3、dsb A1缺失對SH0165生長的影響繪制SH0165、Δdsb A1和C-dsb A1的生長曲線初步探究dsb A1是否對菌株生長產(chǎn)生影響。結(jié)果表明當(dāng)缺失dsb A1基因后,Δdsb A1的OD600值和活菌量均顯著低于SH0165,而dsb A1基因互補后,缺失株的生長表型得到了部分提高�？芍猟sb A1的缺失影響了SH0165的生長。通過掃描電鏡進(jìn)一步觀察dsb A1缺失對生長的影響。本研究選取平板培養(yǎng)至6h、12h和24h的SH0165和Δdsb A1菌苔觀察菌體形態(tài)。比較發(fā)現(xiàn),在6h和12h時Δdsb A1部分細(xì)菌形態(tài)明顯變長,而在24h時得到恢復(fù)。推測dsb A1缺失影響細(xì)菌分裂導(dǎo)致生長滯后。鐵螯合生長實驗初步探究dsb A1影響SH0165生長的機(jī)制。本實驗加入不同濃度的Dip(250μM和300μM)螯合鐵源,檢測各菌株在鐵限制環(huán)境下的生長情況。結(jié)果顯示:在相同Dip濃度下,Δdsb A1的存活情況明顯弱于SH0165,dsb A1缺失影響菌株在鐵限制環(huán)境下的生長。4、dsb A1其它功能研究本課題通過血清抗性實驗探究dsb A1在副豬嗜血桿菌中的作用。選取90%的豬血清與SH0165、Δdsb A1和C-dsb A1相互作用,結(jié)果表明當(dāng)dsb A1缺失后菌株存活能力顯著下降,抵抗血清中補體的溶菌作用減弱。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：2358858