【摘要】：精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性動物生殖細(xì)胞中唯一的干細(xì)胞,在體外長期培養(yǎng)一直是國際性的難題和研究的熱點。目前已經(jīng)建立了小鼠、大鼠和倉鼠三個物種的精原干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)體系,但在其它物種、特別是家畜尚未獲得理想的培養(yǎng)體系。本課題通過檢測分離山羊SSCs的純度來確定最適的實驗動物年齡;利用絲裂霉素-C和胰蛋白酶先后共同處理三種細(xì)胞(MEF、STO、Hela)后,檢測細(xì)胞增殖能力的穩(wěn)定性來篩選出最佳的飼養(yǎng)層制備條件;分別采用不同濃度的血清及三種外源添加物(即枸杞多糖、維生素C、細(xì)胞分裂素)體外培養(yǎng)SSCs,檢測SSCs克隆數(shù)量及其增殖能力,最終確定山羊SSCs體外培養(yǎng)的最佳方案。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.山羊年齡對SSCs分離純化效果的影響分別取2-5月齡的波爾山羊睪丸,以CDH1、UCHL1和THY1作為鑒定山羊SSCs的表面表型標(biāo)記,通過檢測不同月齡山羊睪丸中不同分子標(biāo)記的定位、m RNA和蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示在2、5月齡睪丸中均有CDH1和UCHL1的定位表達(dá);CDH1m RNA和蛋白表達(dá)量隨著月齡增加而下降,其中2月齡表達(dá)量最高;而THY1和UCHL1的表達(dá)量先上升后下降,在3月齡達(dá)到最高值。此結(jié)果表明2-3月齡是分離純化山羊SSCs的最優(yōu)年齡。2.絲裂霉素-C處理時間和胰蛋白酶對飼養(yǎng)層制備效果的影響取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、鼠胚成纖維細(xì)胞系(STO)和子宮頸癌細(xì)胞(Hela)三種細(xì)胞作為飼養(yǎng)層。其中MEF分成6大組,分別用10μg/m L絲裂霉素-C處理不同時間(0h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h)后,各組再分成2小組,其中一組用0.25%胰蛋白酶消化作為處理組,另一組不做處理作為非處理組,并在不同培養(yǎng)時間下檢測增殖能力,以增殖能力穩(wěn)定性和組間差異顯著性作為評定依據(jù)。STO和Hela處理方法同MEF。結(jié)果顯示,非處理組增殖能力穩(wěn)定,而處理組增殖能力不穩(wěn)定,這表明處理組不利于制備飼養(yǎng)層細(xì)胞;在非處理組中,絲裂霉素-C處理MEF細(xì)胞1.5h、STO細(xì)胞2.5h、Hela細(xì)胞2.5h時,細(xì)胞增殖能力比較穩(wěn)定,并與對照組差異顯著(P0.05)。此結(jié)果表明不經(jīng)過胰蛋白酶消化處理的方法最好,并且10μg/m L絲裂霉素-C處理MEF細(xì)胞1.5h,STO細(xì)胞2.5h,Hela細(xì)胞2.5h是最優(yōu)選擇。3.血清濃度對山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度血清(0%、1%、2.5%、5%)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs,以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評定依據(jù)。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)第3d時,5%血清組克隆數(shù)顯著高于其它組(P0.05),但克隆數(shù)隨著時間的增加而大幅度減少,增殖能力明顯下降;在第6d和第10d時,2.5%血清組顯著促進(jìn)SSCs的增殖,并且克隆數(shù)顯著高于其它組(P0.05),增殖速度最快。此結(jié)果表明5%血清濃度不利于SSCs體外長期培養(yǎng),而2.5%血清濃度是體外培養(yǎng)體系的最優(yōu)選擇。4.枸杞多糖濃度對山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度枸杞多糖(LBP)(0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、300μg/m L)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs,以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評定依據(jù)。結(jié)果顯示,200μg/m L和300μg/m L LBP組克隆數(shù)一直顯著低于對照組(P0.05),并且100μg/m L、200μg/m L和300μg/m L LBP組克隆數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而減少;在培養(yǎng)第6d和第10d時,50μg/m L LBP組SSCs克隆數(shù)最多,增殖速度最快。此結(jié)果表明高濃度LBP抑制SSCs增殖,添加50μg/m L LBP是SSCs體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。5.維生素C濃度對山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度維生素C(VC)(0μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、30μg/m L、40μg/m L)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs,以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評定依據(jù)。結(jié)果顯示,隨著時間的增加,各組克隆數(shù)均是先上升后下降;在第6d和第10d時,克隆數(shù)隨著濃度的升高而增加,且各組之間差異顯著(P0.05),但40μg/m L VC組在第7-10d的增殖能力顯著低于其它組(P0.05);在培養(yǎng)第8-10d時,30μg/m L VC組增殖能力基本保持不變,但其它組均下降,并且30μg/m L VC組克隆數(shù)顯著高于其它低濃度組(P0.05)。此結(jié)果表明40μg/m L VC不利于SSCs體外長期培養(yǎng),添加30μg/m L VC是SSCs體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。6.細(xì)胞分裂素濃度對山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)(0ng/m L、25ng/m L、50ng/m L、75ng/m L、100ng/m L、125ng/m L)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs,以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評定依據(jù)。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)第6d和第10d時,100ng/m L 6-BA組克隆數(shù)顯著高于其它組(P0.05),但所有試驗組增殖能力均低于對照組,這表明6-BA不適于SSCs長期體外培養(yǎng)。此結(jié)果表明添加100ng/m L 6-BA是SSCs短期體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。綜上所述,本試驗中體外培養(yǎng)山羊SSCs的最佳條件是,選取2-3月齡的山羊分離睪丸精原干細(xì)胞,同時利用無胰蛋白酶消化處理的MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞和2.5%濃度的血清可以顯著提高SSCs的增殖能力。此外,分別添加50μg/m L LBP或30μg/m L VC或100ng/m L 6-BA均能有效地促進(jìn)體外培養(yǎng)山羊SSCs的增殖,并且添加30μg/m L VC培養(yǎng)的促進(jìn)效果最為顯著。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S827

【參考文獻(xiàn)】

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2 張學(xué)明;李德雪;于家傲;岳占碰;;精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2006年01期

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本文編號：2341154