【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 avian influenza virus,AIV)是低致病性的流感病毒。雞群感染流感病毒后引起免疫系統(tǒng)功能抑制,對(duì)多種病原易感性增加,易繼發(fā)感染大腸桿菌等細(xì)菌性疾病或更嚴(yán)重的臨床疾病。HD-11是雞巨噬細(xì)胞,是禽重要的先天免疫細(xì)胞。本研究通過H9N2 AIV感染HD-11細(xì)胞模擬機(jī)體抗病毒感染的先天免疫反應(yīng),利用免疫熒光方法特異的檢測(cè)H9N2流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染情況;用1 MOI H9N2 AIV感染HD-11細(xì)胞,收集感染后0,6,12,24,36,48,72 h的細(xì)胞樣品,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞模式識(shí)別受體,細(xì)胞因子,趨化因子以及iNOS基因mRNA表達(dá)變化量。通過上述研究方法,我們?nèi)〉昧巳缦略囼?yàn)結(jié)果:1.HD-11細(xì)胞感染病毒12 h后,橢圓形或梭形的HD-11細(xì)胞開始逐漸皺縮變圓,隨后出現(xiàn)胞膜邊緣不齊、拉絲、聚團(tuán)、空泡、脫落等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象。感染H9N2AIV 36 h后,H9N2 AIV NP蛋白單抗免疫熒光染色,細(xì)胞核周圍可見明亮綠色,流感病毒在細(xì)胞內(nèi)分布。2.實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量結(jié)果顯示chTLR7 mRNA在感染后12 h開始顯著上調(diào),感染后48 h,上調(diào)3.8倍,達(dá)到頂峰。chMDA5 mRNA在感染后一直顯著上調(diào),72 h上調(diào)到102.5倍。chMDA5 mRNA上調(diào)作用較chTLR7mRNA更強(qiáng)些。IL-1β,IL-2,IL-6細(xì)胞因子mRNA隨著流感病毒作用時(shí)間延長(zhǎng)開始顯著上調(diào),36h表達(dá)量上調(diào)到最大值,隨后呈顯著下調(diào)趨勢(shì)但仍高于對(duì)照組。IFN-α,IFN-βI型干擾素的mRNA轉(zhuǎn)錄水平從感染后24 h開始顯著上調(diào),72 h分別上調(diào)到48.8倍和11.3倍。XCL1和CXCLi1趨化因子mRNA在感染后12 h開始顯著上調(diào),XCL1 mRNA 36h上調(diào)值最大,CXCLi1趨化因子mRNA在感染后48 h達(dá)到最大值,然后都開始下調(diào);CXCLi2趨化因子mRNA在感染后36 h開始顯著上調(diào),72 h上調(diào)到20倍。iNOS mRNA在病毒感染后12 h開始顯著上調(diào),36 h上調(diào)到最大值,上調(diào)4.3倍。初步探索了流感病毒對(duì)機(jī)體先天免疫功能的影響。
[Abstract]:H9N2 subtype avian influenza virus (H9N2 avian influenza virus,AIV) is a low-pathogenic influenza virus. Chickens infected with influenza virus cause inhibition of immune system, increase susceptibility to various pathogens, and secondary infection with bacterial diseases such as Escherichia coli or more serious clinical diseases. HD-11 is a chicken macrophage. It is an important innate immune cell in birds. In this study, HD-11 cells infected with H9N2 AIV were used to simulate the innate immune response of human body to antiviral infection, and specific immunofluorescence method was used to detect the infection of H9N2 influenza virus in cells. HD-11 cells were infected with 1 MOI H9N2 AIV. The cell samples were collected for 72 h after infection. The expression of cell pattern recognition receptor, cytokines, chemokines and iNOS gene mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Through the above research methods, we obtained the following results: after 1.HD-11 cells were infected with the virus for 12 h, the elliptical or fusiform HD-11 cells began to shrink and round gradually, and then the membrane edge was irregular, drawing wire, agglomeration, vacuoles, and so on. Abscission and other obvious cytopathic phenomena. After 36 h of H9N2AIV infection, the H9N2 AIV NP protein monoclonal antibody was stained with immunofluorescence, the nucleus around the nucleus was bright green, and the influenza virus was distributed in the cells. The results of real-time fluorescence relative quantitative analysis showed that chTLR7 mRNA increased significantly at 12 h after infection and 3.8 times at 48 h after infection, reaching its peak. ChMDA5 mRNA was significantly up-regulated after infection. The up-regulation of chMDA5 mRNA was stronger than that of chTLR7mRNA at 72 h. IL-1 尾, IL-2,IL-6 cytokine mRNA began to be upregulated significantly with the prolongation of influenza virus exposure, and the expression of mRNA increased to the maximum at 36h. The mRNA transcription level of IFN- 偽, IFN- 尾 I interferon increased significantly 24 hours after infection. XCL1 and CXCLi1 chemokine mRNA began to increase significantly at 12 h after infection, XCL1 mRNA at 36 h was the highest, and CXCLi1 chemokine mRNA reached the maximum at 48 h after infection, and then down-regulated. CXCLi2 chemokine mRNA increased significantly at 36 h after infection, increased to 20 fold at 72 h, increased significantly at 12 h after infection, reached the maximum at 36 h, and increased 4.3 times. The effect of influenza virus on innate immune function was preliminarily explored.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2337825