【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom Virus,PRRSV)主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難、高死亡率,具有傳播快、流行范圍廣、高度傳染性等特點,特別是"高致病性豬藍耳病"幾乎蔓延全國各地,造成養(yǎng)豬業(yè)嚴重經(jīng)濟損失。由于本病同其他引起豬繁殖障礙的疾病表現(xiàn)出極為相似的臨床癥狀,并由于新流行毒株的基因發(fā)生了突變,毒力增強,特別是豬群出現(xiàn)了 PRRSV與其他病原如豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等的混合感染,表現(xiàn)為癥狀、病變的非典型化和復雜化,給豬群的臨床診斷和防疫帶來新的難度。為了有效控制PRRS,我國豬群大量使用PRRSV疫苗。由于PRRSV滅活疫苗在臨床使用的防疫效果不穩(wěn)定,目前多用PRRSV弱毒疫苗,而大部分豬群接種PRRSV弱毒疫苗以后,將出現(xiàn)一定時期的病毒血癥,豬體長期帶毒,甚至排毒,豬群一旦感染自然界的野毒,將很難進行鑒別,不利于PRRSV的臨床診斷和控制。因此,有必要建立一套能夠區(qū)分PRRSV自然感染與疫苗免疫的快速鑒別診斷技術。RT-PCR方法是一種可以快速檢測血液、精液以及組織樣品中病毒核酸的生物技術。利用特異性引物進行RT-PCR還可以區(qū)分不同基因型的病毒株。PRRSV的ORF5基因和編碼非結構蛋白2(Nsp2)的Nsp2基因是基因組高度變異的區(qū)域,而且目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV基因缺失主要集Nsp2基因中,GP5和Nsp2蛋白的變異會導致病毒毒力和致病性的差異。本論文開展了兩方面的工作,一是建立了常規(guī)RT-PCR方法,二是用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法檢測了 2011-2014年的部分送檢樣品。結果如下:1常規(guī)RT-PCR方法的建立本研究根據(jù)PRRSV基因編碼區(qū)中變異最大的GP5和非編碼區(qū)中變異最大的Nsp2兩個目的片段,設計了 2對GP5引物(P1和P2)和5對Nsp2引物(N1和N5),克隆了 GP5和Nsp2基因,從中各篩選優(yōu)化出一套效果最好的引物(P2和N3)構建了兩套常規(guī)RT-PCR,并進行了特異性和靈敏度實驗。結果表明,本文建立的常規(guī)RT-PCR僅能擴增出PRRSV毒株,不擴增豬瘟病毒、豬細小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬流感病毒等毒株。擴增GP5雙鏈DNA的靈敏度為700拷貝,擴增GP5基因組的靈敏度為稀釋106倍;擴增Nsp2雙鏈DNA的靈敏度為80拷貝,擴增Nsp2基因組的靈敏度為稀釋107倍。結果表明,本文建立的常規(guī)RT-PCR具有良好的特異性和較高的靈敏度,可用于臨床檢測。2常規(guī)RT-PCR方法的臨床應用采用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法,對2011-2014年送檢的329批血樣、組織病料等進行了檢測。首先,對檢測陽性樣品測序后建立了 PRRSV序列庫,用DNAstar同源性分析軟件對P2引物擴增得到的全部序列及送檢單位使用的疫苗序列進行對比分析,并對4家豬場近4年的陽性序列分別進行同源性分析,結果發(fā)現(xiàn)用本文所構建的常規(guī)RT-PCR方法能明顯區(qū)分野毒株與疫苗株;而且用N3引物擴增得到的序列進行分析,不僅能區(qū)分野毒株與疫苗株,還能進一步區(qū)分毒株為經(jīng)典型還是高致病型。綜上所述,本文建立的兩套常規(guī)RT-PCR方法能較好地鑒別PRRSV的自然感染與疫苗免疫,可用于PRRSV臨床診斷和防控。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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1 Wasin Charerntantanakul;;Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects[J];World Journal of Virology;2012年01期

2 胡鴻惠;曹振;趙鐵柱;王斌;秦亞Z，

本文編號：2328776