【摘要】：牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)為黃病毒科(Flaviviridae),瘟病毒屬(Pestivirus)成員,其感染的宿主范圍較廣,包括牛、羊、鹿、豬等。黃病毒科成員之間基因組的同源性較高,血清學(xué)上存在交叉反應(yīng),并能夠突破宿主特異性發(fā)生交叉感染,從而增加了該病原的診斷和疾病預(yù)防的難度。序列分析表明BVDV E0基因的保守性較高,E0蛋白具有一定的免疫原性,此外該蛋白還具有RNase活性,因此成為研究疾病感染機(jī)制、開(kāi)辟防治疾病新途徑的主要靶蛋白,同時(shí)也具備生產(chǎn)基因工程診斷抗原和基因工程亞單位疫苗的潛力。本研究通過(guò)比對(duì)GenBank中登錄的22株BVDV E0基因序列,其中牛源病毒12株:Oregon C24V(AF091605.1)、NADL(AJ133738.1)、Singer(DQ088995.2)、SD1(M96751.1)、Osloss(M96687.1)、Changchun 184(JN704144.1)、JZ05-1(GQ888686.2)、SH2210-17(HG426493.1)、GS5(KJ541471.1)、Powder(JN380089.1)、Riems(AY078406.1)、10JJ-SKR(KC757383.1),羊源病毒6株:VM(U75982.1)、21372(U75976.1)、R2727(U00891.1)、Ind51966(EU371402.1)、47(U75978.1)、21800(U75977.1),豬源病毒3株:SD0803(JN400273.1)、ZM-95(AF526381.3)、SH-28(HQ258810.1)以及鹿源病毒1株:CCSYD(FJ555203.1)。選擇我國(guó)最早分離且流行較為廣泛的1b基因亞型的Changchun 184株E0基因序列進(jìn)行合成。根據(jù)E0核酸序列設(shè)計(jì)并合成引入IgK信號(hào)肽、預(yù)測(cè)信號(hào)肽、His標(biāo)簽以及NheⅠ酶切位點(diǎn)的上下游引物,以pGSI-E0為模板,通過(guò)PCR分別擴(kuò)增出含有IgK信號(hào)肽、預(yù)測(cè)信號(hào)肽以及不含信號(hào)肽的E0核酸序列,NheⅠ單酶切后與pZJ-CMV-eGFP載體連接,分別構(gòu)建出含IgK信號(hào)肽的pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0載體,含預(yù)測(cè)信號(hào)肽的pZJ-CMV-eGFP-Pre-E0載體以及不含信號(hào)肽的pZJ-CMV-eGFP-E0載體。PCR、酶切及測(cè)序鑒定后,與包裝載體(pVsvg、pAX_2）共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,收集并濃縮三種重組慢病毒,測(cè)定重組慢病毒滴度后感染MDBK細(xì)胞,進(jìn)行熒光觀察,收集MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行western blot分析,結(jié)果表明IgK信號(hào)肽組和預(yù)測(cè)信號(hào)肽組MDBK細(xì)胞均分泌表達(dá)E0蛋白,重組E0蛋白分子量大小約為40ku。為檢測(cè)整合到MDBK細(xì)胞染色體中E0基因的拷貝數(shù),本研究采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)出SYBR GreenⅠ染料法定量PCR檢測(cè)BVDV E0基因的引物,以合成的pGSI-E0重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化,在特異性試驗(yàn)中該方法對(duì)豬瘟病毒、鹿流行性出血病毒-5、藍(lán)舌病病毒(1、5、20型)均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,該方法最低檢出線為20 copies/μL。重復(fù)性試驗(yàn)中組內(nèi)重復(fù)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.018~0.055之間,變異系數(shù)在0.11~0.16%之間;組間重復(fù)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.037~0.096之間,變異系數(shù)在0.17~0.19%之間。結(jié)果表明本研究建立的BVDV E0基因定量PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性、靈敏性和重復(fù)性。將pZJ-CMV-eGFP-Pre-E0組和pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0組MDBK細(xì)胞系連續(xù)傳代,每代消化后均進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~6個(gè)/mL,每隔2代采集細(xì)胞樣品2份,200μL/份,其中1份進(jìn)行流式熒光分析,另1份提取細(xì)胞基因組并進(jìn)行E0基因拷貝數(shù)檢測(cè)。傳代穩(wěn)定性分析結(jié)果表明,兩組細(xì)胞在第12代之后熒光率顯著下降,15代之后E0基因拷貝數(shù)顯著下降。兩組細(xì)胞凍存前后熒光率未發(fā)現(xiàn)顯著變化,因此本研究建立的兩組分泌表達(dá)BVDV E0蛋白的MDBK細(xì)胞系具有較好的傳代、凍存穩(wěn)定性�？傊�,本試驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌表達(dá)BVDV E0蛋白的MDBK細(xì)胞系,并建立了BVDV E0基因定量PCR檢測(cè)方法,為研究E0蛋白的生物學(xué)功能、探索牛病毒性腹瀉病毒的防控措施以及開(kāi)發(fā)基因工程診斷抗原和基因工程亞單位疫苗的奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2328364