【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于低致病性禽流感病毒,感染畜禽后只引起輕微癥狀,但其流行很廣泛,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失,至今仍是重點預防控制家禽疫病之一。此外,該亞型AIV還能夠跨越種間屏障感染哺乳動物和人,對公共衛(wèi)生造成威脅。自1999年以來在我國大陸和香港地區(qū)相繼報道了人感染H9N2亞型AIV的病例,雖然其感染僅能引起人的一些輕微的呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋下降,但是當其它病原混合感染后,病情會加重。此外,H9N2亞型AIV極易發(fā)生突變與重組,產(chǎn)生新的、危害性更大的變異毒株,如H7N9的6個內(nèi)部基因來源于該亞型。所以說H9N2亞型禽流感病毒是影響公眾健康的一個潛在威脅。多年來,對H9N2 AIV的研究主要集中在它的病原學、流行病學以及控制技術上,而對宿主感染的免疫應答過程及其機制了解甚少。基于此,本研究對宿主的免疫反應做了初步的研究。首先,為了挑選出對TC-1細胞較為敏感的H9N2亞型禽流感病毒,對實驗室保存的5株H9N2亞型禽流感病毒進行了病毒滴度的測定以及間接免疫熒光實驗的檢測。對比顯示:CK/SD/ch的病毒滴度最高,CK/SD/w3次之,而后依次是CK/SD/01、CK/SD/836-F1,CK/SD/w4病毒滴度最低。各株禽源流感病毒的毒力強弱不同,但是都能在哺乳細胞上有效復制,這為后續(xù)研究病毒的跨種傳播奠定了基礎。為揭示在流感病毒感染過程中,模式識別受體表達量的多少,以反應機體的天然免疫應答狀況。本研究通過熒光定量PCR和ELISA兩種方法,對三種模式識別受體TLR-3、RIG-I和MDA-5分別在m RNA水平和蛋白水平上進行了檢測。結果顯示,在m RNA和蛋白水平上,MDA-5在這三種模式識別受體中所起的作用更加明顯,上調(diào)幅度最大,m RNA和蛋白水平上分別最大上調(diào)11.5倍和7.5倍。而RIG-I和TLR-3在整個過程中也有所上調(diào),但上調(diào)的倍數(shù)相對較小一些,m RNA和蛋白水平上最大上調(diào)倍數(shù)僅有4.8倍和5.6倍。對本研究所用的三株流感病毒進行比較發(fā)現(xiàn),在m RNA水平上CK/SD/w3所引起的模式識別受體的上調(diào)明顯,在各個時間點的上調(diào)倍數(shù)較另外兩株高0.2-1.4倍。在蛋白水平上,在各個時間點引起的上調(diào)差異不大,三株毒在18h時引起的TLR-3上調(diào)僅約為1.16倍,在24 h時引起MDA-5上調(diào)約為6.4倍,三株毒間差異不明顯。為闡明機體組織細胞抗AIV的炎癥反應過程,采用細胞因子指示其程度。通過熒光定量PCR和ELISA兩種方法對4種細胞因子即IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β進行了檢測。結果顯示,在m RNA水平上,IL-1β、IL-6和IFN-β上調(diào)倍數(shù)相對較大,最大上調(diào)倍數(shù)分別為19.0倍、21.9倍和24.1倍。而TNF-α的上調(diào)倍數(shù)相對較小一些,最大上調(diào)倍數(shù)僅有6.3倍。在本研究所用的三株流感病毒中,CK/SD/w3所引起的IL-1β、IL-6和IFN-β的上調(diào)倍數(shù)較大(18.0-25.0倍);在蛋白水平上各種細胞因子的上調(diào)倍數(shù)基本相似,在6h、12、和18h時上調(diào)不明顯,甚至有些細胞因子有些許下調(diào)。值得注意的是在蛋白水平上,各個時間點,各個毒株間細胞因子的上調(diào)倍數(shù)差異性不大,且上調(diào)倍數(shù)不大,僅僅有2-4倍的上調(diào)。這些細胞因子均為促炎癥因子,參與機體的抵抗流感病毒的免疫反應。生理狀態(tài)下,這些細胞因子的含量很低,但是在機體遭受侵害的情況下,這些因子快速,大量的釋放導致炎癥反應促進疾病的進程。趨化因子在動物機體中也是一種重要的免疫因子,它在趨化炎癥因子到達炎癥反應部位過程中作用明顯。因此本研究還對5種趨化因子(IL-8、Ccl-2、Ccl-3、RAN TES和IP-10)進行了檢測。結果顯示:在m RN A水平上,這幾種趨化因子都有明顯的上調(diào),上調(diào)倍數(shù)最大的是Ccl-3(最大上調(diào)倍數(shù)為19.1倍)。在蛋白水平上,上調(diào)最明顯的為RANTES,最大上調(diào)倍數(shù)為35.9倍。而在各個毒株之間進行比較發(fā)現(xiàn),m RNA水平上,CK/SD/w3和CK/SD/w4實驗組的各種趨化因子上調(diào)均很明顯,CK/SD/w3在12 h時誘導Ccl-3上調(diào)倍數(shù)最大(19.1倍),CK/SD/w4在36 h時誘導IL-8上調(diào)倍數(shù)最大為17.1倍。而CK/SD/ch僅僅對Ccl-3的上調(diào)較為明顯(上調(diào)倍數(shù)為12.5倍)。在蛋白水平上,三株毒在各個時間點的各種趨化因子上調(diào)倍數(shù)差異不明顯,但是CK/SD/w3誘導上調(diào)的倍數(shù)更大一些。這些趨化因子由單核細胞、巨噬細胞分泌產(chǎn)生,在機體中趨化因子可以招募游離的單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞穿過血管內(nèi)皮到達炎癥部位。趨化因子上調(diào)越明顯,說明招募的炎性細胞和炎性因子越多,而引起的炎癥反應越嚴重。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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