【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于低致病性禽流感病毒,感染畜禽后只引起輕微癥狀,但其流行很廣泛,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失,至今仍是重點(diǎn)預(yù)防控制家禽疫病之一。此外,該亞型AIV還能夠跨越種間屏障感染哺乳動(dòng)物和人,對公共衛(wèi)生造成威脅。自1999年以來在我國大陸和香港地區(qū)相繼報(bào)道了人感染H9N2亞型AIV的病例,雖然其感染僅能引起人的一些輕微的呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋下降,但是當(dāng)其它病原混合感染后,病情會(huì)加重。此外,H9N2亞型AIV極易發(fā)生突變與重組,產(chǎn)生新的、危害性更大的變異毒株,如H7N9的6個(gè)內(nèi)部基因來源于該亞型。所以說H9N2亞型禽流感病毒是影響公眾健康的一個(gè)潛在威脅。多年來,對H9N2 AIV的研究主要集中在它的病原學(xué)、流行病學(xué)以及控制技術(shù)上,而對宿主感染的免疫應(yīng)答過程及其機(jī)制了解甚少�；诖�,本研究對宿主的免疫反應(yīng)做了初步的研究。首先,為了挑選出對TC-1細(xì)胞較為敏感的H9N2亞型禽流感病毒,對實(shí)驗(yàn)室保存的5株H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行了病毒滴度的測定以及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的檢測。對比顯示:CK/SD/ch的病毒滴度最高,CK/SD/w3次之,而后依次是CK/SD/01、CK/SD/836-F1,CK/SD/w4病毒滴度最低。各株禽源流感病毒的毒力強(qiáng)弱不同,但是都能在哺乳細(xì)胞上有效復(fù)制,這為后續(xù)研究病毒的跨種傳播奠定了基礎(chǔ)。為揭示在流感病毒感染過程中,模式識(shí)別受體表達(dá)量的多少,以反應(yīng)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答狀況。本研究通過熒光定量PCR和ELISA兩種方法,對三種模式識(shí)別受體TLR-3、RIG-I和MDA-5分別在m RNA水平和蛋白水平上進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,在m RNA和蛋白水平上,MDA-5在這三種模式識(shí)別受體中所起的作用更加明顯,上調(diào)幅度最大,m RNA和蛋白水平上分別最大上調(diào)11.5倍和7.5倍。而RIG-I和TLR-3在整個(gè)過程中也有所上調(diào),但上調(diào)的倍數(shù)相對較小一些,m RNA和蛋白水平上最大上調(diào)倍數(shù)僅有4.8倍和5.6倍。對本研究所用的三株流感病毒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),在m RNA水平上CK/SD/w3所引起的模式識(shí)別受體的上調(diào)明顯,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上調(diào)倍數(shù)較另外兩株高0.2-1.4倍。在蛋白水平上,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)引起的上調(diào)差異不大,三株毒在18h時(shí)引起的TLR-3上調(diào)僅約為1.16倍,在24 h時(shí)引起MDA-5上調(diào)約為6.4倍,三株毒間差異不明顯。為闡明機(jī)體組織細(xì)胞抗AIV的炎癥反應(yīng)過程,采用細(xì)胞因子指示其程度。通過熒光定量PCR和ELISA兩種方法對4種細(xì)胞因子即IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,在m RNA水平上,IL-1β、IL-6和IFN-β上調(diào)倍數(shù)相對較大,最大上調(diào)倍數(shù)分別為19.0倍、21.9倍和24.1倍。而TNF-α的上調(diào)倍數(shù)相對較小一些,最大上調(diào)倍數(shù)僅有6.3倍。在本研究所用的三株流感病毒中,CK/SD/w3所引起的IL-1β、IL-6和IFN-β的上調(diào)倍數(shù)較大(18.0-25.0倍);在蛋白水平上各種細(xì)胞因子的上調(diào)倍數(shù)基本相似,在6h、12、和18h時(shí)上調(diào)不明顯,甚至有些細(xì)胞因子有些許下調(diào)。值得注意的是在蛋白水平上,各個(gè)時(shí)間點(diǎn),各個(gè)毒株間細(xì)胞因子的上調(diào)倍數(shù)差異性不大,且上調(diào)倍數(shù)不大,僅僅有2-4倍的上調(diào)。這些細(xì)胞因子均為促炎癥因子,參與機(jī)體的抵抗流感病毒的免疫反應(yīng)。生理狀態(tài)下,這些細(xì)胞因子的含量很低,但是在機(jī)體遭受侵害的情況下,這些因子快速,大量的釋放導(dǎo)致炎癥反應(yīng)促進(jìn)疾病的進(jìn)程。趨化因子在動(dòng)物機(jī)體中也是一種重要的免疫因子,它在趨化炎癥因子到達(dá)炎癥反應(yīng)部位過程中作用明顯。因此本研究還對5種趨化因子(IL-8、Ccl-2、Ccl-3、RAN TES和IP-10)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示:在m RN A水平上,這幾種趨化因子都有明顯的上調(diào),上調(diào)倍數(shù)最大的是Ccl-3(最大上調(diào)倍數(shù)為19.1倍)。在蛋白水平上,上調(diào)最明顯的為RANTES,最大上調(diào)倍數(shù)為35.9倍。而在各個(gè)毒株之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),m RNA水平上,CK/SD/w3和CK/SD/w4實(shí)驗(yàn)組的各種趨化因子上調(diào)均很明顯,CK/SD/w3在12 h時(shí)誘導(dǎo)Ccl-3上調(diào)倍數(shù)最大(19.1倍),CK/SD/w4在36 h時(shí)誘導(dǎo)IL-8上調(diào)倍數(shù)最大為17.1倍。而CK/SD/ch僅僅對Ccl-3的上調(diào)較為明顯(上調(diào)倍數(shù)為12.5倍)。在蛋白水平上,三株毒在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各種趨化因子上調(diào)倍數(shù)差異不明顯,但是CK/SD/w3誘導(dǎo)上調(diào)的倍數(shù)更大一些。這些趨化因子由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生,在機(jī)體中趨化因子可以招募游離的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮到達(dá)炎癥部位。趨化因子上調(diào)越明顯,說明招募的炎性細(xì)胞和炎性因子越多,而引起的炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2326454