【摘要】：布氏桿菌為胞內(nèi)寄生菌,主要寄生于機(jī)體的單核細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)的生存和復(fù)制是布氏桿菌的主要毒力特征。非編碼小RNA(small nocoding RNA,sRNAs)是細(xì)菌代謝、毒力和適應(yīng)環(huán)境壓力的重要調(diào)節(jié)因子,在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌中的sRNA有兩種形式:順式編碼sRNA和反式編碼sRNA。反式編碼sRNA與靶標(biāo)基因的mRNA不完全堿基配對(duì),調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性或是改變翻譯機(jī)制,細(xì)菌中以這種非編碼RNA為主。這類小RNA主要分布在蛋白編碼序列之間,即基因間區(qū)。在革蘭氏陰性菌中,Hfq可以輔助小RNA與靶標(biāo)基因的互補(bǔ)配對(duì)。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和Northern實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在羊布魯氏菌的兩條染色體上共發(fā)現(xiàn)了 15個(gè)新的sRNA,BSR1141即為其中之一。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)BSR1141在布魯氏菌在適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境中的調(diào)控作用進(jìn)行了深入的研究。試驗(yàn)Ⅰ布氏桿菌sRNA—BSR1141的預(yù)測(cè)及鑒定為了進(jìn)一步驗(yàn)證sRNA—BSR1141的存在及分析其分子特征,本研究首先通過首先通過RACE方法尋找BSR1141的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和終點(diǎn),并通過MFOLD軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后利用RT-PCR和Northern的方法,分析BSR1141RNA在各種條件下的轉(zhuǎn)錄水平。最后通過RT-PCR分析BSR1141與hfq的相關(guān)性。RACE結(jié)果表明BSR1141位于布氏桿菌Ⅰ號(hào)染色體BMEI1140和BMEI1141之間基因間區(qū)的正義鏈上,方向?yàn)椤L(zhǎng)73 nt。它的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為1187396,轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)為1187668。RT-PCR和Northern結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSR1141在模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的刺激條件下表達(dá)水平增加,提示BSR1141有可能在布魯氏菌適應(yīng)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境壓力中發(fā)揮作用;同時(shí)也表明BSR1141 是 hfq 依賴性 sRNA。試驗(yàn)Ⅱ布氏桿菌BSR1141突變株的構(gòu)建及表型試驗(yàn)為了進(jìn)一步確定BSR1141在布魯氏菌適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境和胞內(nèi)生存中的作用,本論文構(gòu)建了 BSR1141缺失突變株和過表達(dá)株,并對(duì)野生株、BSR1141缺失突變株及過表達(dá)株的胞內(nèi)生存相關(guān)表型進(jìn)行了比較,包括生長(zhǎng)速度、體外模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下的生存能力及小鼠毒力。結(jié)果顯示:與野生株相比,BSR1141突變株和過表達(dá)株生長(zhǎng)速度減慢、在體外刺激條件下的生存能力降低、小鼠感染后脾臟載菌數(shù)下降,證實(shí)BSR1141與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力密切相關(guān)。試驗(yàn)Ⅲ BSR1141通過靶標(biāo)基因來介導(dǎo)布氏桿菌毒力及環(huán)境適應(yīng)力由于sRNA主要通過靶標(biāo)mRNA來發(fā)揮作用,為了從基因水平上進(jìn)一步探討B(tài)SR1141在胞內(nèi)生存中如何發(fā)揮作用。本試驗(yàn)通過TargetRNA、RNAPredator、sTarPicker這3種常用的生物信息學(xué)軟件對(duì)BSR1141的靶mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)并通過RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到了 43條靶mRNA,包括布氏桿菌毒力因子VirB2、外膜蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(tetR、GntR)、熱休克蛋白及一些代謝相關(guān)基因等,且BSR1141對(duì)大部分靶標(biāo)基因表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控,這提示BSR1141可能就是通過調(diào)控大量靶標(biāo)基因,影響了菌體的毒力、代謝、生長(zhǎng)能力以及對(duì)不利環(huán)境的抵抗力,從而導(dǎo)致表型上的改變。virB操縱子由同一啟動(dòng)子調(diào)控編碼ⅣV型分泌系統(tǒng)(Type ⅣV secretion systems,T4SS),它是一個(gè)含有11個(gè)可跨越細(xì)菌被膜的多蛋白復(fù)合物,是病原菌的一個(gè)重要毒力武器,而virB2是T4SS成員之一,已有研究表明virB2缺失后,布氏桿菌毒力下降。GntR和tetR作為一種很廣泛存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能夠與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控作用。本試驗(yàn)在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇毒力基因virB2及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR和tetR進(jìn)一步研究BSR1141對(duì)靶標(biāo)基因的具體調(diào)控機(jī)制,首先通過在線預(yù)測(cè)軟件sTarPicker預(yù)測(cè)出BSR1141與三個(gè)靶標(biāo)可能的結(jié)合位點(diǎn),然后通過雙質(zhì)粒系統(tǒng)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證BSR1141于這3個(gè)靶mRNA的結(jié)合;最后結(jié)合qRT-PCR分析BSR1141對(duì)T48S整體的調(diào)控作用。結(jié)果表明:BSR1141分別與GntR mRNA的5'UTR和tetR mRNA的編碼起始位點(diǎn)發(fā)生不完全互補(bǔ)配對(duì),抑制GntR和tetR的翻譯水平,這提示BSR1141可能通過下調(diào)GntR和tetR的蛋白表達(dá)水平,從而影響GntR和tetR作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的下游效應(yīng),進(jìn)而呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),調(diào)控菌體的毒力、初級(jí)代謝、抗生素代謝及胞內(nèi)生存能力。同時(shí)BSR1141通過靶基因virB2的5'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì),調(diào)控virB2的表達(dá),而且這個(gè)過程需要分子伴侶Hfq的參與。然而qRT-PCR結(jié)果表明BSR1141對(duì)整個(gè)virB族基因轉(zhuǎn)錄水平存在影響,除virB2外,其余的10個(gè)virB基因均受BSR1141的負(fù)調(diào)控作用,這提示BSR1141除了直接上調(diào)virB2的表達(dá),還間接影響其它virB基因的表達(dá),因此BSR1141整體上對(duì)T4SS呈負(fù)調(diào)控作用,從而降低了菌體毒力水平,不利于布魯氏菌在各種條件下的生存能力。試驗(yàn)Ⅳ sRNA(BSR0602和BSR1141)通過雙向調(diào)控sodA的表達(dá)介導(dǎo)內(nèi)源性氧代謝SodA是錳超氧化物歧化酶,廣泛存在于微生物體內(nèi),是生物抗氧化酶類的重要成員,維持布氏桿菌體內(nèi)活性氧代謝平衡。本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)sodA是布氏桿菌另一個(gè)sRNA—BSR0602的靶標(biāo)基因,而在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BSR1141與布氏桿菌抵御胞內(nèi)惡劣環(huán)境有關(guān),特別是對(duì)氧壓特別敏感;且sodA也是BSR1141的靶標(biāo)基因之一。以sodA為研究對(duì)象,進(jìn)一步研究BSR1141和BSR0602是如何調(diào)控布氏桿菌對(duì)氧壓的適應(yīng)性。本研究通過雙向電泳技術(shù)對(duì)布氏桿菌野生株16M和BSR0602過表達(dá)株的全菌蛋白譜進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示BSR0602過表達(dá)后,布氏桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)代謝蛋白和壓力適應(yīng)蛋白的表達(dá)發(fā)生變化。qRT-PCR和HIS表位標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)BSR0602和BSR1141在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均影響氧壓力適應(yīng)蛋白SodA的表達(dá)。相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示16M-BSR0602和16M-BSR1141對(duì)氧壓力更為敏感,證實(shí)了 BSR0602和BSR1141在布氏桿菌適應(yīng)氧壓力中的作用。這提示BSR0602和BSR1141這兩個(gè)sRNA共同調(diào)控sodA基因的表達(dá),相互協(xié)作,維持內(nèi)源性氧代謝的動(dòng)態(tài)平衡。通過本試驗(yàn),本論文在布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與毒力和胞內(nèi)生存能力相關(guān)的sRNA BSR1141。BSR1141通過下調(diào)GntR、tetR和virB族基因的表達(dá)來影響布魯氏菌的毒力以及布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存能力。由于BSR1141下調(diào)而不是增強(qiáng)布魯氏菌的毒力,因此影響B(tài)SR1141的表達(dá)水平,將有可能阻斷或抑制細(xì)菌的致病力,從而達(dá)到抗感染的目的,這可以作為一個(gè)新穎的抗感染策略基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2323679