【摘要】：本研究通過間接免疫熒光技術(shù),確定了EHV-1囊膜蛋白gD單獨(dú)表達(dá)于BHK-21細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況,為其亞細(xì)胞定位機(jī)制及病毒二級(jí)囊膜的研究奠定了基礎(chǔ)。以EHV-1基因組為模板,利用PCR方法擴(kuò)增gD部分基因,并構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET28-gD,轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用Ni-NTA親和層析法純化gD重組蛋白;以純化的重組蛋白為抗原免疫實(shí)驗(yàn)小鼠并制備抗囊膜蛋白gD的多克隆抗體;分別以間接ELISA方法及Western blot方法檢測抗體效價(jià)及反應(yīng)性;人工轉(zhuǎn)染pVAX-Kozak-gD重組質(zhì)粒至BHK-21細(xì)胞,利用IF技術(shù)對(duì)囊膜蛋白gD進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明:成功表達(dá)了大小約29kD的gD重組蛋白;制備的多克隆抗體效價(jià)為1∶102 400,能較好地與囊膜蛋白gD真核表達(dá)產(chǎn)物特異性結(jié)合;通過IF方法確定囊膜蛋白gD大部分呈斑點(diǎn)狀分布于宿主細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中,極少量定位于細(xì)胞核內(nèi)。
[Abstract]:In this study, the localization of EHV-1 envelope protein gD in BHK-21 cells was determined by indirect immunofluorescence technique, which laid a foundation for the study of its subcellular localization mechanism and the study of virus secondary envelope. Using EHV-1 genome as template, some gD genes were amplified by PCR method, and its prokaryotic expression vector pET28-gD, was constructed for expression in BL21 (DE3) receptive cells. GD recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purified recombinant protein was used as antigen to immunize mice and the polyclonal antibodies against gD were prepared, and the titers and reactivity of the antibodies were detected by indirect ELISA and Western blot, respectively. PVAX-Kozak-gD recombinant plasmid was artificially transfected into BHK-21 cells and subcellular localization of envelope protein gD was performed by IF technique. The results showed that the recombinant gD protein of about the size of 29kD was successfully expressed, and the polyclonal antibody titer was 1: 102,400, which could bind well with the eukaryotic expression product of gD. By IF method, most of the gD were speckled in the cytoplasm around the host nucleus, and a very small number of them were located in the nucleus.
【作者單位】： 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院;新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所;
【基金】：新疆維吾爾自治區(qū)高等學(xué)�？蒲杏�(jì)劃(項(xiàng)目號(hào):XJEDU2014S024),題目:馬皰疹病毒Ⅰ型囊膜蛋白gD亞細(xì)胞定位研究 新疆維吾爾自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(項(xiàng)目號(hào):201610758167),題目:馬皰疹病毒Ⅰ型囊膜蛋白gD的原核表達(dá)~~
【分類號(hào)】：S852.652

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本文編號(hào)：2317420