【摘要】：2011年太湖突發(fā)以鴨軟腳,排白色稀糞為主要特征的傳染病,發(fā)病率達(dá)40%,病死率達(dá)10%~20%,帶給養(yǎng)鴨業(yè)較大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原為呼腸毒病毒(DRV),雙鏈無囊膜,屬于RNA病毒,至今,關(guān)于該病毒的感染與免疫機(jī)制還不清楚。RIG-I識別胞質(zhì)內(nèi)的RNA病毒,很快啟動多種信號級聯(lián)反應(yīng),激活合成一系列細(xì)胞因子,如I型干擾素,起到抗病毒感染天然免疫的作用。RIG-I可辨識包括DRV在內(nèi)的雙鏈RNA(dsRNA)病毒。但是,其在抗DRV感染過程中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究在克隆鴨的RIG-I基因的基礎(chǔ)上,采用已建立的定量RT-PCR方法,結(jié)合其它方法,檢測了鴨RIG-I抗鴨呼腸孤病毒感染的功能,為深入探究鴨的抗病毒感染天然免疫及DRV的感染機(jī)理等奠定了基礎(chǔ)。1.鴨RIG-I全基因的克隆根據(jù)已發(fā)表的鴨RIG-I基因序列,設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增櫻桃谷肉鴨RIG-I全基因的一對引物。序列分析結(jié)果表明櫻桃谷肉鴨的RIG-I全基因長2802bp,含有一個(gè)讀碼框(ORF),編碼933個(gè)氨基酸。鴨RIG-I基因具有RLR家族的典型特征,N端由兩個(gè)半胱天冬酶活化和募集結(jié)構(gòu)域組成,C端由RNA解旋酶,ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抑制結(jié)構(gòu)域RD組成,RIG-I蛋白第806~929位之間是高度保守的結(jié)構(gòu)功能域。序列比對分析結(jié)果顯示,櫻桃谷肉鴨RIG-I的序列與已報(bào)道的番鴨RIG-I序列同源性最高,為98.4%~99.8%,與鵝的同源性較高,為95.9%;但與人、鼠、草魚的同源性較低,分別為62.3%、61.5%、61.2%;與豬的同源性最低,僅為54.4%,表明RIG-I基因在不同種屬之間存在很大差異性。2.DRV熒光定量PCR檢測方法的建立將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pET-30a-DRVδC(本實(shí)驗(yàn)室保存)定量后,10倍稀釋,做8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù),系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。本研究成功建立DRV標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)R2=0.998,系統(tǒng)生成的回歸方程為:Y=-3.458x+42.19,最低可檢測底物濃度為100copies/?L。3.鴨RIG-I熒光定量PCR檢測方法的建立我們擴(kuò)增鴨RIG-I基因,將其克隆到PEASY-T5載體上,測序正確后,將其定量后作為重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍稀釋,做8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng),系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,本研究成功建立鴨RIG-I標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)R2=0.998,系統(tǒng)生成的回歸方程為:Y=-3.327 x+33.01,溶解曲線峰單一,最低可檢測底物濃度為10copies/?L。4.鴨RIG-I轉(zhuǎn)染細(xì)胞對DRV復(fù)制的影響為了驗(yàn)證鴨RIG-I是否具有抗病毒功能,我們將duRIG-I轉(zhuǎn)染DEF和DF1細(xì)胞,感染DRV后發(fā)現(xiàn)其均能增強(qiáng)I型干擾素和Mx活性,病毒滴度降低。本研究表明外源表達(dá)鴨RIG-I可發(fā)揮抗DRV效應(yīng)。5.內(nèi)源性鴨RIG-I在抗DRV病毒感染中的作用為了驗(yàn)證duRIG-I是否引起DRV先天性免疫,我們首先檢測了鴨RIG-I組織分布,然后用DRV分別感染DEF和鴨,發(fā)現(xiàn)DEF感染DRV后duRIG-I mRNA,IFN-αm RNA,Mx mRNA水平均上調(diào),感染DRV后鴨的脾和腎中duRIG-I mRNA,IFN-αmRNA,MxmRNA水平均出現(xiàn)上調(diào),體內(nèi)體外試驗(yàn)中病毒增殖均受到抑制。本試驗(yàn)獲得鴨的RIG-I基因,進(jìn)行了一系列的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn),證明鴨RIG-I在抗DRV先天性免疫中發(fā)揮重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.32

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)會議論文 前1條

1 陳少鶯;陳仕龍;林鋒強(qiáng);王劭;江斌;程曉霞;朱小麗;張世忠;李兆龍;程由銓;;新型鴨呼腸孤病毒病研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

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本文編號：2314871