【摘要】：大腸桿菌腹瀉是獸醫(yī)臨床常見的致死率較高病癥之一。為了科學(xué)研究不同藥物對于大腸桿菌腹瀉的防治機制,許多研究者通過建立試驗動物大腸桿菌腹瀉模型,如大鼠、小鼠、兔和豚鼠等,觀察檢測模型動物的腹瀉情況,臨床癥狀,組織器官病理變化和腸道黏膜修復(fù)相關(guān)的細胞因子(如EGF、TGF-β、TGF-α等),并且腸道黏膜修復(fù)相關(guān)細胞因子的表達水平可評估藥物對于受損腸道的作用。本研究以白術(shù)多糖能緩解大腸桿菌腹瀉癥狀為目標,在建立小鼠大腸桿菌腹瀉模型的基礎(chǔ)上,以白術(shù)健脾益氣,能醫(yī)泄利,保護腸道等功能為切入點,通過統(tǒng)計大腸桿菌腹瀉小鼠腹瀉率,腹瀉指數(shù),觀察小鼠臨床癥狀,剖檢癥狀,組織學(xué)形態(tài)變化,超微結(jié)構(gòu)變化,并利用免疫組化和實時熒光相對定量法檢測腸道黏膜修復(fù)細胞因子和基因的表達情況,來探索評價白術(shù)多糖對于大腸桿菌腹瀉的作用,并初步探討其防治腹瀉的機制。試驗一小鼠大腸桿菌腹瀉模型的建立本試驗通過構(gòu)建小鼠大腸桿菌感染模型,觀察小鼠腹瀉情況、臨床癥狀與剖檢癥狀,應(yīng)用切片技術(shù)、電鏡技術(shù)對小鼠的組織學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)變化進行觀察。方法:將20只ICR小鼠隨機。分成兩組,模型組與空白組。模型組腹腔注射大腸桿菌O1115.4×107cfu/ml,空白組注射等體積生理鹽水,統(tǒng)計小鼠的稀便級,計算稀便率,剖檢小鼠,制作H.E切片、透射電鏡切片、掃面電鏡樣品。結(jié)果:24h時,模型組小鼠腹瀉率為100%,腹瀉指數(shù)為0.34,與空白組差異顯著,腹瀉模型成功造模成功;攻菌后24h后,模型組小鼠各段腸道均有損傷;十二指腸的損傷較為嚴重,腸絨毛變短,絨毛結(jié)構(gòu)被破壞,腸壁破損;透射電鏡下可觀察到模型組線粒體腫脹,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。試驗二白術(shù)多糖對小鼠大腸桿菌腹瀉防治效果的影響本試驗通過研究白術(shù)多糖對腹瀉小鼠的臨床癥狀、剖檢變化的影響,探討白術(shù)多糖對大腸桿菌造成小鼠腹瀉的防治效果,為揭示白術(shù)多糖對小鼠腹瀉的防治機制提供前提。方法:購買白術(shù)粉末用醇沉法制白術(shù)多糖,制得粗多糖后用苯酚-硫酸法測定多糖含量,結(jié)果:白術(shù)含多糖38.76%。隨機選取ICR小鼠100只隨機分為4組,即空白組,治療組,預(yù)防組,陽性組,每組25只。預(yù)防組提前3d灌胃白術(shù)多糖0.04mg/ml,0.2ml/只(多糖:0.0059mg/只)。治療組,預(yù)防組,陽性組腹腔注射大腸桿菌5.4×107cfu/ml(0.1ml/只),空白對照組注射等體積生理鹽水。觀察小鼠的腹瀉情況。分別于1h,8h,24h,48h,72h,96h,120h每組撲殺剖檢3只小鼠。記錄小鼠剖檢情況。結(jié)果:陽性組6h開始出現(xiàn)腹瀉癥狀,預(yù)防組與治療組8h開始出現(xiàn)腹瀉癥狀,剖檢發(fā)現(xiàn)預(yù)防組小鼠小腸有輕微出血癥狀,治療組小鼠十二指腸暗紅充血,腸壁變薄,陽性組小鼠腸道充血出血,十二指腸段充血較嚴重;24h時陽性組的腹瀉率為82.6%,與預(yù)防組43.48%和治療組34.8%差異顯著(P0.05),陽性組的腹瀉指數(shù)也顯著高于預(yù)防組與治療組(P0.05);96h后,預(yù)防組與治療組開始好轉(zhuǎn),陽性組小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)癥狀較嚴重,用藥組小鼠恢復(fù)時間較短,腸道恢復(fù)情況較好。結(jié)果表明白術(shù)多糖對大腸桿菌所導(dǎo)致的小鼠腹瀉有一定的防治效果,主要體現(xiàn)在腹瀉初期白術(shù)多糖減緩腹瀉癥狀,保護腸道粘膜,對于大腸桿菌所致腹瀉的后續(xù)治療有一定效果。試驗三白術(shù)多糖對大腸桿菌腹瀉小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)的影響為進一步探究白術(shù)多糖對受損腸道黏膜的影響,本試驗使用白術(shù)多糖作用于大腸桿菌腹瀉模型的小鼠,觀察小鼠組織形態(tài)和超微組織形態(tài)變化,進一步探索白術(shù)多糖對小鼠腹瀉的防治機制。方法:多糖制備和小鼠分組處理方法同試驗二,小鼠分別于]h,8h,24h,48h,72h,96h,120h時每組剖檢3只小鼠,取十二指腸制作H.E切片、掃描電鏡切片與透射電鏡切片,結(jié)果表明,攻菌后1h,預(yù)防組無較明顯病變;治療組腸腺出血,輕微水腫,掃描電鏡下腸絨毛較整齊;陽性組腸腺有出血,腸絨毛開始萎縮,掃描電鏡下絨毛頂端脫落損壞,部分絨毛萎縮。24h時,陽性組腸絨毛大量損壞脫落,癥狀較預(yù)防組與治療組嚴重。96h時預(yù)防組與治療組開始好轉(zhuǎn),陽性組癥狀嚴重。透射電鏡下可觀察到,小鼠腹瀉中期時即24h之后,用藥組小鼠腸上皮細胞微絨毛排列較整齊,線粒體腫脹,核變形,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張;陽性組小鼠腸上皮細胞微絨毛減少,倒伏,細胞核高度不規(guī)則,大量線粒體變性形成髓鞘樣結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量擴張含有顆粒狀包涵體。結(jié)果表明白術(shù)多糖用藥組對于小腸上皮細胞微絨毛保護較好,白術(shù)多糖具有保護腸道粘膜的作用,參與細胞代謝的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器的病變程度較輕說明白術(shù)多糖可能對腸道因子有有益的調(diào)節(jié)作用。試驗四白術(shù)多糖對大腸桿菌腹瀉小鼠腸道修復(fù)機制的研究本試驗通過免疫組化和real time PCR的方法來研究腸道損傷后,隨著時間的變化,白術(shù)多糖對腸道內(nèi)的表皮生長因子受體EGFR和TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)的影響。方法:藥物制備與小鼠分組處理同試驗二,分別于1h,8h,24h,48h,72h,96h,120h每組撲殺剖檢3只小鼠,制作免疫組化切片和用real time PCR法來檢測腸道中EGFR和TGF-β1的表達情況。結(jié)果:腹瀉初期,空白組與其余各組小鼠EGFR陽性染色大部分出現(xiàn)在隱窩上皮細胞的細胞質(zhì)上;TGF-β1陽性染色位于小腸淋巴細胞、巨噬細胞以及部分小腸上皮細胞的胞漿內(nèi);此時各組EGFR和TGF-β1的表達量與空白組無顯著性差異;腹瀉中期,腸黏膜損傷最為嚴重,此時EGFR與TGF-β1出現(xiàn)大量陽性染色,此時EGFR與TGF-β1表達量分別達到峰值,各組表達量與空白組相比差異顯著(P0.05);腹瀉后期,預(yù)防組與治療組EGFR表達量與24h相比降低但差異不顯著,陽性組EGFR表達量大幅度減少,差異極顯著(P0.01),說明白術(shù)多糖能影響EGFR的表達,使其維持在一個較高的表達水平中,促進上皮細胞快速增殖;各組TGF-β1陽性表達減弱,但預(yù)防組與治療組TGF-β1表達量較高,說明白術(shù)多糖對于TGF-β1有調(diào)節(jié)作用,通過調(diào)節(jié)TGF-β1來促進腸道黏膜修復(fù)。結(jié)論:白術(shù)多糖對大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠腹瀉有一定防治效果,能有效減緩腹瀉癥狀,減少小鼠的腹瀉率。剖檢發(fā)現(xiàn)對腹瀉小鼠的腸道有明顯的保護作用,預(yù)防組小鼠的保護效果最好,恢復(fù)時間最短。觀察超微組織學(xué)變化發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖對腸上皮細胞的微絨毛、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等具有保護作用,促進細胞較快的恢復(fù)正常代謝。主要原因是白術(shù)多糖對腸道黏膜修復(fù)因子EGFR和TGF-β1的調(diào)節(jié),促進腸道黏膜修復(fù),從而在腹瀉初期白術(shù)多糖能有效的保護腸道粘膜,腹瀉中后期白術(shù)多糖能使黏膜上皮細胞的更早恢復(fù)正常代謝。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S853.74

【參考文獻】

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本文編號：2312163