【摘要】：鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci, Cps)是一種專性細胞內寄生、具有獨特二相發(fā)育周期的人獸共患病原菌。根據最新分類方法,Cps歸類到衣原體屬、衣原體科、衣原體目。20世紀30年代Cps曾在12個國家發(fā)生大流行,特別是1930年美國馬里蘭州的Cps疫情直接促使了美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的成立。Cps廣泛感染動物,可導致流產、關節(jié)炎等疾病,人類不是Cps的天然宿主,可因吸入分泌物或與鳥類的密切接觸而感染,引起肺炎等疾病,稱為鸚鵡熱。其傳播途徑廣泛,人類可通過氣溶膠、皮膚、粘膜、眼結膜和傷口等引起感染,重癥感染可出現全身中毒癥狀、急性腎功能衰竭、胰腺炎等,甚至死亡。由于易通過氣溶膠—呼吸道途徑傳播和高致病性,Cps是被列入國際《禁止生物武器公約》的經典生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。由于培養(yǎng)純化困難、對生物安全條件要求高、屬生物恐怖劑范疇等原因,國內外只有極少數實驗室從事Cps基礎研究。國內外口前還沒有Cps特有毒力基因的報道,對Cps致病機制的理解主要來自對其它衣原體種特別是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)的研究。Ct是沙眼和最常見的性傳播疾病的病原體。本課題研究對象是Cps的CT135同源基因,這是因為CT135是新發(fā)現的Ct毒力基因,有三個表型：(1)在未經體外培養(yǎng)的臨床樣本中,CT135基因是完整的：(2)具有完整CT135基因的Ct在細胞上連續(xù)傳代時,會自然發(fā)生無義突變并獲得生長優(yōu)勢；(3)不可思議的是,兩株同時發(fā)生CT135移碼突變的Ct D型菌株在雌鼠生殖道感染模型中有顯著的毒力差異。目前Ct CT135基因是否編碼蛋白質、蛋白質的定位、蛋白質的功能、其它衣原體種的同源基因是否有類似表型等都還不清楚。本課題目的是分析國內Cps流行株的CT135同源基因的多態(tài)性、體外穩(wěn)定性、蛋白質的表達和定位,并探索構建Cps CT135同源基因的無義突變體,以加深理解CT135及其同源基因的致病機制。在Ct基因組上,CT134、CT135、CT136三個功能未知的基因可能組成一個操縱子,這三個基因的Cps同源基因分別為B598_0589、B598_0590和B598_0557,它們的氨基酸同源性分別為26%,21%和65%。鑒于Ct的這三個基因可能組成操縱子,本課題分析了這三個同源基因的蛋白質表達和定位。本課題首先建立了基于Cel Ⅰ酶的單核苷酸突變檢測技術,分析了庫存Cps菌株B598_0590基因的多態(tài)性和體外穩(wěn)定性。利用硫酸銨沉淀法從西芹汁中提取了Cel Ⅰ酶,經雜合雙鏈DNA酶切鑒定,提取的Cel Ⅰ酶具有良好的單核苷酸突變檢測活性。用Cel Ⅰ酶對庫存九株Cps的B598_0590基因進行了突變分析,發(fā)現庫存Cps菌株的B598_0590均不存在多態(tài)性,進一步基因測序分析發(fā)現所有菌株均編碼完整的B598_0590,測序圖譜上各堿基無明顯重疊峰(這與Cel Ⅰ結果相一致)。考慮到國內Cps菌株均為雞胚分離和傳代,而不是國外常用的細胞法,而Ct CT135基因多態(tài)性在雞胚模型中還缺乏研究。我們利用乙基乙烷磺酸酯(EMS)處理Cps CG1株后,分成24組在Vero細胞上連續(xù)傳代20次,使CG1株適應Vero,然后進行基因測序分析,發(fā)現24組CG1的B598_0590均保持完整。顯然,以上發(fā)現與Ct中報道的CT135的體內外不穩(wěn)定性不一致。衣原體在特有的包涵體內增殖,其蛋白質可定位于菌體內部及表面、包涵體腔及包涵體膜、和細胞質。定位于包涵體膜和細胞質的衣原體蛋白可與細胞質直接接觸,被認為與調控宿主信號通路相關。本課題利用原核表達載體pGEX-4T-1和pEASY-Blunt E1表達純化了Cps CG1株的B598_0589、B598_0590、B598_0557、包涵體膜蛋白IncA、主要外膜蛋白MOMP和分泌蛋白CPAF,免疫小鼠制備了抗血清。采用共聚焦免疫熒光法,在感染后30小時,發(fā)現B598_0590的染色特征與IncA相似之處是包涵體膜濃染,這表明B598_0590編碼包涵體膜蛋白；二者不同之處是多數包涵體內部也有B598_0590著色,說明該蛋白可能也在菌體或包涵體腔內分布。B598_0589與B598_0557的染色特征與MOMP相似,說明它們可能為菌體膜蛋白。免疫印跡實驗進一步確認了抗血清的特異性,且沒有發(fā)現三個功能未知蛋白存在翻譯后修飾。Cps B598_0590編碼包涵體膜蛋白的發(fā)現在LpxC抑制劑和青霉素測試實驗中得到了進一步驗證。青霉素不影響Ct包涵體的生長、染色體復制但可有限影響菌體分裂及網狀體至原體的轉化,此時網狀體體積顯著增大。LpxC抑制劑是一種新型抗生素,可抑制細菌類脂A的合成。據報道,該抗生素不影響Ct的包涵體發(fā)育和正常生長分裂,但會顯著抑制網狀體至原體的轉化和菌體感染性。這兩種藥物對Cps生長發(fā)育的影響還缺乏研究,但如果導致菌體體積增大會有助于分析比較蛋白質的定位。本研究發(fā)現LpxC抑制劑和青霉素均可顯著抑制CG 1的菌體分裂和包涵體生長,共聚焦免疫熒光發(fā)現兩種抗生素對CG1蛋白質的表達有不同的影響。例如,青霉素可完全抑制IncA的分泌,而LpxC抑制劑處理的CG1仍能將IncA分泌至包涵體膜,形成典型的空泡結構。重要的是,經LpxC抑制劑處理的CG1經B598_0590抗血清染色后也能形成類似IncA染色的空泡結構,這進一步證實了B598_0590編碼包涵體膜蛋白。以上發(fā)現Cps B598_0590編碼包涵體膜蛋白也與生物信息學分析結果相一致。據文獻報道,包涵體膜蛋白含有一段約60個氨基酸組成的兩個連續(xù)的疏水裂片(lobe)。經比對預測,CT135同源基因在衣原體屬內的12個種都存在,且有相似的疏水特征,它們都有相同大小的兩個連續(xù)的疏水裂片。研究者利用此特征已在Ct中鑒定了多個包涵體膜蛋白,并預測Ct的CT134、CT135均編碼包涵體膜蛋白,但沒有對這兩個蛋白進行鑒定。本研究發(fā)現,Cps B598_0589、 B598_0590分別與CT134、CT135同源,但只有B598_0590是包涵體膜蛋白。為進一步比較Cps與Ct包涵體膜蛋白的種類和同源性,研究中對Cps GR9株基因組中的所有假設蛋白和膜蛋白進行了疏水性分析,與基因組中注釋的三個包涵體膜蛋白一起,共發(fā)現了46個可能的包涵體膜蛋白。這些蛋白中,除了已明確IncA與包涵體融合有關,其它均為功能未知蛋白。而且,只有21個Cps包涵體膜蛋白在Ct中有同源蛋白,B598_0590即是其中之一,這21個蛋白在衣原體屬中全部存在同源蛋白,這說明這些少數同源的包涵體膜蛋白高度保守,可能有類似的功能、可能與對人的致病性相關,而多數沒有同源性的包涵體膜蛋白可能與衣原體的宿主特異性有關。為進一步研究B598_0590的功能,本研究探索了TargeTron基因敲除技術在Cps中的應用。首先設計了B598_0590基因的Ⅱ型內含子插入位點和引物,構建了基于pACD4K-C的敲除載體,并在E. coli中驗證了敲除載體插入滅活質粒載體攜帶的B598_0590基因的可行性。目前Ct的質粒轉化多使用p-內酰胺酶作為篩選標記,因此用Mlu Ⅰ切除了敲除載體的卡那霉素抗性基因,并重新引入了p-內酰胺酶基因,在此基礎上將Ⅱ型內含子的啟動子在T7基礎上分別增加CpsB598_0249基因或ompA基因的啟動子,從而完成了基于兩個Cps內源啟動子的B598_0590敲除載體的構建,這為下一步構建Cps突變體奠定了基礎。為制備衣原體屬特異性的LPS表位抗原和抗體,本研究利用TargeTron技術初步構建了表達衣原體LPS表位的大腸桿菌突變體。衣原體的LPS實質上是由數個Kdo組成的脂寡糖,衣原體屬內各種的LPS均有保守且特殊的a-Kdo-(2→8)-a-Kdo結構,該表位由多功能的Kdo轉移酶KdtA負責合成。先用T載體將Ct L2的kdtA基因克隆入E. coli BL21(DE3),然后利用TargeTron技術在E. coli的內源kdtA基因內插入Ⅱ型內含子,獲得了突變體E. coli kdtA::GⅡ CtkdtA。免疫熒光實驗表明該突變體可表達衣原體屬特異性的Kdo表位。將該E. coli突變體甲醛滅活后免疫小鼠,獲得的免疫血清可與Cps發(fā)生特異反應,說明重組的Kdo表位具有良好的免疫原性,可用于制備衣原體屬特異性抗體。綜上所述,本研究建立了基于Cel Ⅰ酶的單核苷酸突變檢測技術,可用于今后建立基于TILLING的Cps反向遺傳學技術；利用Cel Ⅰ酶和測序方法分析了國內Cps流行株的基因多態(tài)性和體外細胞模型上的穩(wěn)定性,發(fā)現國內Cps菌株的CT135同源基因均保持完整,在Vero細胞上CG1株的CT135同源基因可能與生長適應性無明顯關聯(lián)：采用生物信息學方法預測了Cps編碼的所有包涵體膜蛋白,并通過生物信息學方法、共聚焦免疫熒光、青霉素和LpxC抑制劑測試實驗一致發(fā)現Cps的CT135同源基因B598_0590編碼包涵體膜蛋白,而Cps的CT134、 CT136同源基因可能編碼膜蛋白；構建了重組表達B598_0589、B598_0590、 B598_0557、IncA、MOMP、CPAF和衣原體屬特異性Kdo表位的E. coli工程菌、兩個不同的B598_0590基因敲除質粒,為深入研究Cps CT135同源基因的功能奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.67

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本文編號：2304320