【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種有V⒛さ惱碦NA病毒。它屬于動脈炎病毒科,尼多病毒目。PRRSV感染能夠?qū)е伦胸i、育肥豬急性呼吸困難,妊娠母豬繁殖障礙,給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。盡管多年以來人們對PRRSV致病機理進行了深入的研究,并發(fā)現(xiàn)了許多有重要意義的成果,但是這些研究主要針對于PRRSV引起宿主免疫反應(yīng)的機制。我們對于PRRSV的增殖機制如病毒的復(fù)制,入胞,組裝,釋放機制了解的還很有限。本研究主要針對PRRSV入胞過程中誘導(dǎo)細胞激活的信號通路及其分子機制進行了深入探討,系統(tǒng)分析了PRRSV入胞的分子機制。主要研究內(nèi)容包括:1 FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路參與PRRSV入胞過程運用Western Blot技術(shù),激光共聚焦技術(shù),熒光定量PCR技術(shù)我們對PRRSV(JXA1)株在進入MARC-145細胞及PAM細胞過程中激活的信號分子進行了分析。結(jié)果表明,PRRSV在進入細胞過程中可以激活FAK,PI3K,AKT,Rac1信號分子,并且可以重構(gòu)細胞微絲骨架,誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生片狀偽足。我們利用信號分子的特異性抑制劑來驗證它們在信號通路中的上下游關(guān)系,FAK的特異性抑制劑PF573228可以抑制PI3K,AKT,Rac1信號分子激活,PI3K的特異性抑制劑LY294002可以抑制AKT與Rac1激活。對細胞瞬時轉(zhuǎn)染Rac1持續(xù)性激活表達質(zhì)�？梢赞卓笰KT抑制劑對病毒入胞的影響。進一步研究表明FAK,PI3K,AKT,Rac1的特異性抑制劑都可以抑制病毒入胞。所以我們的實驗證明了病毒的入胞過程會激活FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路,并且PRRSV入胞過程需FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路激活。2、整合素αv亞基可以將信號傳遞給FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路我們對PRRSV進入MARC-145細胞過程中整合素亞基的分布,及作用進行了分析。結(jié)果表明,PRRSV在進入細胞過程中可以使整合素αv亞基進行重新分布,并且病毒粒子在入胞過程中與αv亞基共定位。在病毒入胞過程中無法與整合素β1亞基共定位,也無法使β1亞基進行重新分布。所以整合素αv亞基在病毒入胞過程中可能會起作用。通過實驗我們發(fā)現(xiàn),整合素αv亞基中和抗體可以抑制病毒入胞,用RNA干擾技術(shù)特異性干擾整合素αv亞基以后病毒入胞水平降低。為驗證整合素αv亞基在信號通路傳導(dǎo)中的作用,我們利用αv亞基中和抗體和RNA干擾來處理細胞,結(jié)果表明抑制αv亞基的功能可以顯著抑制FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路。在干擾αv亞基以后補加下游信號分子PI3K的激活劑可以使病毒入胞水平回升。而整合素的激活劑Mn~(2+)可以促進病毒粒子入胞,并且可以促進信號通路激活。為驗證脂筏在αv亞基傳導(dǎo)信號過程中的作用,利用激光共聚焦等方法我們發(fā)現(xiàn),在PRRSV入胞過程中整合素αv亞基會轉(zhuǎn)移到脂筏中,并且脂筏的完整性對于信號通路的傳導(dǎo)都是必須的。以上實驗結(jié)果表明在病毒入胞過程中,整合素αv亞基可以脂筏中將信號傳遞給FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路,從而促進病毒入胞。3、細胞內(nèi)ROS、Ca~(2+)參與PRRSV入胞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程運用流式細胞術(shù)等方法我們對PRRSV(JXA1株)在進入MARC-145細胞過程中激活的細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(ROS)進行定量分析,結(jié)果表明,PRRSV(JXA1株)在進入細胞過程中可以刺激細胞產(chǎn)生ROS。通過Western Blot技術(shù),熒光定量PCR技術(shù),我們對ROS的作用進行了分析。結(jié)果表明,ROS的特異性清除劑NAC可以抑制病毒入胞,另外NAC可以抑制病毒在入胞過程中激活的FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路。TLR4的特異性抑制劑TAK242可以抑制由病毒入胞誘導(dǎo)的ROS,并且TAK242同樣可以抑制病毒入胞與信號通路激活。除此之外,細胞內(nèi)Ca~(2+)的螯合劑BAPTA-AM也能夠抑制PRRSV入胞與信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些實驗表明細胞內(nèi)的ROS與Ca~(2+)參與病毒入胞與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。4、PRRSV可能通過結(jié)構(gòu)蛋白GP3上的RHD基序與整合素結(jié)合整合素需要通過配體上的特定序列與之相結(jié)合,根據(jù)已經(jīng)報道結(jié)合肽的基序,我們在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白GP3上找到了基序RHD,在GP2a上找到了LDV序列。因此PRRSV可能會通過這些基序與整合素相結(jié)合,從而促進自身的入胞。實驗結(jié)果表明RHD肽可以特異性地抑制病毒入胞但并不影響病毒吸附,另外RHD肽可以抑制FAK-PI3K-AKT-Rac1信號通路。以上實驗表明PRRSV可能是通過GP3上的RHD序列與整合素相結(jié)合從而促進自身入胞。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
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本文編號：2269442