【摘要】：犢牛大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌引起的新生幼犢的一種急性傳染病,主要表現(xiàn)為腹瀉,嚴(yán)重者因功能衰竭、脫水和酸中毒而死亡,也有的表現(xiàn)為敗血癥癥狀,常給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起犢牛腹瀉的大腸桿菌主要毒力因子有腸毒素(不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素)、志賀毒素和黏附素,其中不耐熱腸毒素II型(Type II heat-labile enterotoxin,LT-II)可引起犢牛嚴(yán)重的腹瀉。國內(nèi)外對(duì)于LT-II相關(guān)研究較少,因此,深入研究LT-II的生物學(xué)活性可對(duì)防治大腸桿菌性犢牛腹瀉具有重要意義,為犢牛大腸桿菌性腹瀉疫苗研究奠定基礎(chǔ)。本研究通過對(duì)2010-2012年東北地區(qū)12個(gè)規(guī)�；B(yǎng)牛場(chǎng)犢牛腹瀉糞便中分離的381株大腸桿菌樣品進(jìn)行LT-II基因的PCR檢測(cè),有10株大腸桿菌帶有LT-II基因。核苷酸序列分析結(jié)果顯示,8株為LT-IIc1基因、1株為LT-IIc4基因、1株為LT-IIc6基因。將優(yōu)勢(shì)基因型LT-IIc1毒素基因雙順反子的ORF克隆入p ET30a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化Rossatta感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)r LT-IIc1重組蛋白,同時(shí)構(gòu)建了LT-IIc1A、B亞基的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21/pHUE-LT-IIc1-A、BL21/p HUE-LT-IIc1-B和BL21/pGEX-6p-1-LT-IIc1-B,并對(duì)應(yīng)表達(dá)r LT-IIc1-A、r LT-IIc1-B和rpLT-IIc1-B。用Y-1細(xì)胞檢測(cè)rLT-IIc1對(duì)細(xì)胞的毒性作用。將r LT-IIc1、r LT-IIc1-A、r LT-IIc1-B三種重組蛋白與白油佐劑1:1混合后,分別進(jìn)行腹腔注射和滴鼻免疫6周齡小鼠,用間接ELISA定期檢測(cè)血清中特異性Ig G和IgA抗體水平;Y-1細(xì)胞體外中和試驗(yàn)檢測(cè)高效價(jià)小鼠血清的中和效價(jià)。選取8月齡海蘭褐蛋雞,用以上三種抗原進(jìn)行胸肌注射免疫,定期收集雞蛋,用間接ELISA檢測(cè)卵黃抗體效價(jià);Y-1細(xì)胞體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高價(jià)卵黃抗體中和效價(jià)。SDS-PAGE分析和Western blot鑒定結(jié)果顯示,以上四種重組蛋白均獲得高效表達(dá)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示,r LT-IIc1可以使Y-1小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的病變,其細(xì)胞最小致死量為17.8pg。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,在腹腔注射途徑中,r LT-IIc1免疫組小鼠血清中特異性Ig G效價(jià)水平最高,A亞基效價(jià)為1:10610、B亞基效價(jià)為1:14400,高于其他免疫組;在滴鼻免疫組中,LT-IIc1重組蛋白組小鼠血清中特異性Ig A效價(jià)也為最高,A亞基滴度為1:3400、B亞基滴度為1:3600,同樣也高于其他免疫組各組。體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,腹腔注射組中r LT-IIc1組小鼠血清抗體中和效價(jià)為1:52。在三種免疫原免疫蛋雞后均在三免后14d卵黃抗體水平達(dá)到最高,其中r LT-IIc1組卵黃抗體水平較高,A亞基為1:6120、B亞基為1:8630;重組蛋白B亞基組卵黃抗體效價(jià)高達(dá)1:9670;重組蛋白A組卵黃抗體效價(jià)僅為1:3600;各組高效價(jià)卵黃抗體體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,rLT-IIc1組中和效價(jià)為1:24;r LT-IIc1-A組中和效價(jià)為1:7;r LT-IIc1-B組中和效價(jià)為1:19。研究表明r LT-IIc1對(duì)Y-1細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,并對(duì)小鼠和雞均有良好的免疫原性,免疫血清和卵黃抗體對(duì)LT-II具有中和作用。該研究為犢牛大腸桿菌性腹瀉疫苗抗原基因的選擇奠定了基礎(chǔ)。卵黃抗體對(duì)LT-II較好的中和作用,為臨床防治犢牛大腸桿菌性腹瀉提供了潛在的生物制劑和對(duì)LT-II的檢測(cè)抗體。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 王麗榮;董永軍;梁美蘭;;牛病毒性腹瀉病毒的病原學(xué)與診治[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年12期

2 許英民;;新生犢牛腹瀉發(fā)生的原因及防治[J];獸醫(yī)導(dǎo)刊;2010年08期

3 楊曜中,宋聿文,歐伶,范龍彬,袁勤生;雞卵黃抗體的制備及其不均一性[J];華東理工大學(xué)學(xué)報(bào);2000年01期

4 袁超文;劉文鑫;關(guān)瑋琨;孟相秋;唐杰;李星月;趙志騰;師東方;;牛源產(chǎn)Ⅱ型不耐熱腸毒素大腸桿菌的分離鑒定及重組毒素制備[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年08期

5 葉樹華;;牛冠狀病毒病的防治[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2008年06期

6 介春霞,任修宇;犢牛腹瀉的診療[J];中國獸醫(yī)雜志;2005年07期

7 王宣;文道富;朱中華;;犢牛寄生蟲性腹瀉的治療[J];中國畜禽種業(yè);2009年05期

8 王小剛;;初春要防犢牛副傷寒[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2009年06期

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1 高睿;陜西省犢牛大腸桿菌性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查及初步免疫試驗(yàn)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2258948