【摘要】：豬胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)所造成的一種豬呼吸道疾病。該病在1957年P(guān)attison第一次報(bào)道,目前已經(jīng)遍布在全世界的各地,導(dǎo)致養(yǎng)豬行業(yè)的巨額經(jīng)濟(jì)損失。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的抗生素能夠所引起細(xì)菌的耐藥性,而且現(xiàn)代人極為廣泛關(guān)注綠色食品的安全問(wèn)題,現(xiàn)階段預(yù)防和治療胸膜肺炎病普遍使用的方法就是接種疫苗。在1996年Frey從胸膜肺炎放線桿菌中克隆了一種脂蛋白PalA,其大小約是14 kDa, PalA與流感嗜血桿菌P6蛋白和一種巴氏桿菌外膜蛋白同源性比較高,而后兩種已經(jīng)被證明是保護(hù)性蛋白,另外大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明有許多種類的革蘭氏陰性細(xì)菌中的PAL蛋白家族具有比較強(qiáng)的免疫原性特點(diǎn),因此我們的目的蛋白PalA很有可能是治療豬胸膜肺炎候選亞單位疫苗的有效組成部分,令科學(xué)家驚奇的是,Frey在2003年的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)這種脂蛋白PalA對(duì)于亞單位疫苗有免疫有不利影響,我們知道目前滅活疫苗成本低而且在生產(chǎn)實(shí)際中使用比較多,本研究主要是借助小鼠模型來(lái)探究PalA蛋白對(duì)于滅活疫苗免疫效力的影響。首先,本實(shí)驗(yàn)對(duì)目的基因palA進(jìn)行克隆和目的PalA蛋白表達(dá)純化,利用新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行兔多克隆抗體的制備,實(shí)驗(yàn)組的2只新西蘭大白兔用PalA免疫四次,另外一只免疫PBS作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn),第二次加強(qiáng)免疫后的第十四天,將兔子動(dòng)脈放血后進(jìn)行血清的徹底分離,然后利用96孔ELISA板測(cè)定制備的多克隆抗體血清的效價(jià)高低,我們實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果1：25600,另外,實(shí)驗(yàn)中提取了胸膜肺炎放線桿菌1型SLW01菌株的亞細(xì)胞的各個(gè)成分,通過(guò)Western blotting分析最終顯示了目的PalA是一種外膜蛋白。其次,我們利用純化的重組蛋白rPalA和胸膜肺炎放線桿菌SLW01滅活菌苗進(jìn)行了不同組合的皮下免疫小鼠后腹腔攻毒,實(shí)驗(yàn)中選取了40只生理狀況相同的6周齡大的Balb/C雌性小鼠分成5個(gè)小組,第一組是用PBS免疫的對(duì)照組,第二組是rPalA組,第三組是胸膜肺炎放線桿菌的SLW01滅活菌苗Bac組,第四組是蛋白疫苗混合BacPal組,第五組是胸膜肺炎放線桿菌的商品三價(jià)疫苗ComV組。免疫分三次進(jìn)行,每次的中間間隔時(shí)間是14天,第2次加強(qiáng)免疫兩周后,以～5×LD5o劑量(2.5×106CFU)的APP血清1型4074菌株腹腔攻毒,攻毒后記錄小鼠在一天后的體重變化和小鼠5天內(nèi)的死亡數(shù)量,計(jì)算各組小鼠的體重?fù)p失率和存活率,依據(jù)這些指標(biāo)分析目的蛋白rPalA對(duì)于滅活疫苗免疫效果的影響,每次免疫前和攻毒前對(duì)小鼠進(jìn)行尾部的靜脈取血并且分離血清,利用間接ELISA測(cè)定小鼠血清對(duì)于三種不同的抗原rPalA, ApxIA, ApxIIA的抗體水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,第二組的PalA抗體效價(jià)極顯著高于第三組(P0.01),然而,第三組滅活疫苗組卻顯示了比較高的外毒素ApxIA和ApxIIA的抗體效價(jià),最后一次免疫后外毒素的抗體效價(jià)差異達(dá)到了極顯著水平(P0.01)。另外,第三組的免疫小鼠經(jīng)過(guò)APP血清1型4074菌株的攻擊后,表現(xiàn)了100%的保護(hù),而BacPal免疫的小鼠僅僅提供75%的保護(hù),除此之外,相對(duì)于滅活疫苗組,BacPal免疫的小鼠體重?fù)p失顯著(P0.05)。最后,我們用24只生理狀況相同的6周齡Balb/C雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行了被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)平均分成3組,分別用不同的抗血清皮下免疫,第一組免疫融合蛋白rPalA的抗血清,第二組免疫滅活的胸膜肺炎放線桿菌血清1型SLW01菌的抗血清,第三組免疫滅活A(yù)PP SLW01菌和rPalA混合抗血清,免疫抗血清3 h后,用APP血清1型菌株4074以～5×LD5o(2.5×106 CFU)進(jìn)行腹腔攻毒,記錄小鼠5天內(nèi)的死亡率,并用福爾馬林將死亡小鼠的肺部固定然后制作病理切片,切片用HE染色后鏡檢觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滅活疫苗組抗血清,BacPal的抗血清分別提供了的100%、37.5%的保護(hù),病理切片的結(jié)果顯示滅活疫苗和目的融合蛋白rPalA混合的抗血清的肺部病變更加嚴(yán)重,肺部組織有出血和滲出的纖維蛋白。總之,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目的蛋白PalA不是免疫保護(hù)性的抗原,PalA抗體能夠?qū)px毒素抗體的產(chǎn)生不利的負(fù)面影響和削弱滅活疫苗的免疫效力。
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【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 逯忠新,趙萍,邵英德,柳紀(jì)省,魯炳義,邱昌慶,李寶玉,葉培根,陳煥春,吳斌;豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗的研究——效力、最小免疫量、免疫持續(xù)期和保存期試驗(yàn)[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2002年05期

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本文編號(hào)：2258629