【摘要】：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由鐮刀菌屬真菌在生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。DON屬于天然化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊,人工合成較為困難。然而商品化DON價格昂貴,不能滿足實(shí)驗(yàn)室大量DON毒理學(xué)研究的需要。DON可以通過污染的糧食作物引起人和動物的中毒。豬是對DON最敏感的動物,DON可以明顯引起豬的拒食、體重下降等癥狀。DON有免疫調(diào)節(jié)的作用,高濃度的DON可導(dǎo)致免疫抑制,表現(xiàn)為循環(huán)淋巴細(xì)胞減少;低濃度的DON可以刺激某些細(xì)胞因于和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。有報道表明,DON和某些鐮刀菌屬毒素可以增加機(jī)體對病毒的易感性。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是危害養(yǎng)殖業(yè)的一個重要病毒,可嚴(yán)重?fù)p害種畜的生殖機(jī)能和仔豬的呼吸功能。本研究制備純化DON樣品,并將其利用到毒理學(xué)研究中。研究了 DON對生長在細(xì)胞上的PRRSV復(fù)制的影響,DON對感染PRRSV的細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響及細(xì)胞凋亡情況,探討DON對PRRSV在體外復(fù)制的影響的機(jī)理。對感染PRRSV的仔豬飼喂含不同濃度的DON的日糧,研究DON在動物體內(nèi)對PRRSV的感染的影響。試驗(yàn)Ⅰ小麥樣品中DON的分離純化禾谷鐮刀菌PH-1產(chǎn)生的孢子液接種到小麥培養(yǎng)基上,小麥發(fā)生霉變后,HPLC測產(chǎn)毒量。霉變小麥粉碎后,加入乙腈/水(84:16,v/v)萃取液,經(jīng)振蕩、抽濾、脫脂、旋轉(zhuǎn)蒸干后,得到棕色粘稠狀浸膏。該浸膏與粗顆粒硅膠拌料后,經(jīng)過第一次硅膠柱,分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇進(jìn)行洗脫,TLC檢測DON樣品存在乙酸乙酯溶液中。濃縮該溶液,與較細(xì)顆粒的硅膠拌料后,經(jīng)過第二次硅膠柱層析,用二氯甲烷/甲醇(19:1,v/v)作為洗脫液,得到DON的粗提物。粗提物經(jīng)過制備型HPLC,收集含有DON單峰的樣品,經(jīng)分析型HPLC檢測,與DON標(biāo)準(zhǔn)品有相同的出峰時間,可以初步判定該樣品為DON。該樣品經(jīng)HPLC-MS、NMR結(jié)構(gòu)鑒定,和間接競爭ELISA免疫學(xué)鑒定為DON。本研究中,1kg小麥培養(yǎng)基得到433 mg DON粗提物,經(jīng)純化后得到293 mg DON樣品,本試驗(yàn)的回收率接近70%。經(jīng)計算,該DON的純度達(dá)90%以上,可以用來進(jìn)行毒理學(xué)研究。試驗(yàn)ⅡDON對PRRSV在體外復(fù)制的影響為了研究DON對PRRSV體外復(fù)制的影響,本試驗(yàn)選取PRRSV的體外培養(yǎng)細(xì)胞MARC-145細(xì)胞進(jìn)行研究。分別研究了不同濃度的DON對未感染病毒的細(xì)胞的活力LDH活性的影響;對已感染PRRSV的細(xì)胞的活力、LDH活性的影響;DON對接種在細(xì)胞上PRRSV抗原量以及病毒滴度的影響;DON對PRRSV N蛋白復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,較高濃度的DON(500～800ng·mL-1)可導(dǎo)致正常細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化,甚至脫落;細(xì)胞的活力降低(P0.05);LDH活性升高(P0.05),因此本試驗(yàn)研究濃度小于500 ng·mL-1的DON對PRRSV復(fù)制的影響。PRRSV感染細(xì)胞后,出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變,加入50 ng·mL-1DON時,細(xì)胞的病變情況和細(xì)胞活力沒有明顯變化。當(dāng)DON濃度為150～200 ng·mL-1時,感染PRRSV的細(xì)胞存在病變,但細(xì)胞活力顯著高于對照組(P0.05);LDH活性顯著低于對照組(P0.05);間接免疫熒光試驗(yàn)表明PRRSV抗原量減少;病毒滴度顯著低于對照組(P0.05);Western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明,N蛋白復(fù)制受到抑制。以上試驗(yàn)結(jié)果說明DON濃度為150～200 ng·mL-1時,可以抑制PRRSV在細(xì)胞上的復(fù)制。試驗(yàn)ⅢDON對感染PRRSV細(xì)胞的細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡的影響PAM為PRRSV感染的天然靶細(xì)胞,為了進(jìn)一步探討DON對PRRSV復(fù)制影響的機(jī)理,本試驗(yàn)研究DON對PAM的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響。分別研究了DON濃度為200 ng·mL-1時,對抗病毒細(xì)胞因子IFN-α和IFN-β和促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,對于未感染PRRSV的細(xì)胞,200 ng·mL-1DON染毒組的IFN-α和IFN-βmRNA表達(dá)水平與對照組無顯著性差異;細(xì)胞感染PRRSV后,IFN-α和IFN-β相對表達(dá)水平有所升高,但與對照組差異不顯著;感染PRRSV的細(xì)胞中加入DON后,IFN-α和IFN-β的表達(dá)水平升高,與對照組差異顯著(P0.05),抗病毒細(xì)胞因子的升高與DON抑制PRRSV的復(fù)制有關(guān)。DON可以使未感染PRRSV的細(xì)胞中IL-1β和IL-6相對表達(dá)升高,與對照組差異顯著(P0.05);PRRSV感染細(xì)胞中IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平升高,但與對照組無顯著性差異;DON使感染PRRSV的細(xì)胞中IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平升高,與對照組差異顯著(P0.05)。DON引起的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)升高與其抑制PRRSV在細(xì)胞上的復(fù)制有關(guān)。本試驗(yàn)還應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了DON對感染PRRSV的細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞感染PRRSV后,加入DON濃度為50 ng·mL-1時細(xì)胞凋亡率與不加DON的對照組差異不顯著,DON濃度為150～200 ng·mL-1細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P0.05)。DON引起的細(xì)胞凋亡威脅細(xì)胞上PRRSV的存活,導(dǎo)致PRRSV在細(xì)胞上的復(fù)制受到抑制。試驗(yàn)ⅣDON對PRRSV體內(nèi)感染的影響為了研究DON對PRRSV體內(nèi)感染的影響,本試驗(yàn)選取28日齡斷奶仔豬進(jìn)行試驗(yàn)研究。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組,每組10頭豬,4組動物隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)組1為對照組,飼喂基礎(chǔ)日糧。其余3組試驗(yàn)組的豬各滴鼻、肌肉接種1 mL JXA1株MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)液,病毒滴度為1×105TCID50·mL-1。試驗(yàn)組2飼喂基礎(chǔ)日糧;試驗(yàn)組3飼喂基礎(chǔ)日糧添加3 mg·kg-1 DON;試驗(yàn)組4飼喂基礎(chǔ)日糧添加5 mg·kg-1 DON。分別測量4組實(shí)驗(yàn)動物的生長性能、體溫、血液及肺臟樣本中的PRRSV病毒載量、血清樣本中抗PRRSV特異性抗體的免疫應(yīng)答及免疫組化檢測肺組織中的PRRSV含量。結(jié)果顯示,飼喂添加DON的日糧可導(dǎo)致感染PRRSV的仔豬生長性能降低;體溫升高;血液中PRRSV病毒載量增加;肺臟組織中PRRSV含量增加;血清中針對PRRSV的特異性抗體應(yīng)答增強(qiáng)。感染PRRSV的仔豬飼料中添加DON導(dǎo)致仔豬PRRSV感染的癥狀加劇,甚至死亡。本試驗(yàn)結(jié)果與體外試驗(yàn)結(jié)果相矛盾,這是由于體內(nèi)和體外試驗(yàn)環(huán)境不同引起的,本試驗(yàn)中日糧中添加DON的濃度尚未達(dá)到DON對PRRSV復(fù)制的抑制作用,DON在該濃度作用主要發(fā)揮引起動物拒食、嘔吐等毒性作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2257266